SN∕T 4877.9-2017 基因条形码筛查方法 第9部分：检疫性腥黑粉菌(出入境检验检疫).pdf

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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 基因条形码筛查方法第部分：检疫性腥黑粉菌犇犖犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犻 狀 犵狊 犮 狉 犲 犲 狀 犻 狀 犵犿犲 狋 犺 狅 犱犘 犪 狉 狋：犙狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言 基因条形码筛查方法分为 个部分：第部分：检疫性棒形杆菌；第部分：检疫性黄单胞菌；第部分：检疫性植原体；第部分：检疫性茎点霉；第部分：检疫性拟茎点霉；第部分：检疫性嗜酸菌；第部分：检疫性轮枝菌；第部分：检疫性炭疽菌；第部分：检疫性腥黑粉菌；第 部分：检疫性疫霉

2、。本部分为 的第部分。本部分按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、王颖、高瑞芳、汪莹、潘广、向才玉、冯建军、史亚千、王红英、谢晓露。犛犖犜 基因条形码筛查方法第部分：检疫性腥黑粉菌范围 的本部分规定了小麦印度腥黑穗病菌犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪犻 狀犱 犻 犮 犪和小麦矮化腥黑穗病菌犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪犮 狅 狀 狋 狉 狅 狏 犲 狉 狊 犪的条形码筛查中序列的

3、扩增、分析及结果判定等。本部分适用于小麦印度腥黑穗病菌和小麦矮化腥黑穗病菌的筛查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。犇犖犃条形码犇犖犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犲生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的片段。内部间隔转录区序列犻 狀 狋 犲 狉 狀 犪 犾狋 狉 犪 狀 狊 犮 狉 犻 犫 犲 犱狊 狆 犪 犮 犲 狉；犐 犜犛在

4、真核生物中，核糖体是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从到依次为：外部转录间隔区、基因、内部转录间隔区（）、基因、内部转录间隔区（）、基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于、和 之间的区域，和 作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。检疫性腥黑粉菌的基本信息英文名：学名：犻 狀犱 犻 犮 犪中文名：小麦印度腥黑穗病菌学名：犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪犮 狅 狀 狋 狉 狅 狏 犲 狉 狊 犪中文名：小麦矮化腥黑穗病菌分

5、类学地位：真菌界（）、担子菌门（）、黑粉菌纲（）、黑粉菌目（）、腥黑粉菌科（）、腥黑粉菌属（犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪）犛犖犜 方法原理利用片段作为检疫性病菌的条形码基因，通过对检测对象的进行扩增及产物测序后，利用生物条形码数据（）或中国检疫性有害生物条形码数据库比对，根据序列相似度筛查物种。仪器设备和试剂 仪器设备超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、低温冰箱、扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。试剂氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、乙醇、无水乙醇、饱和酚、犜犪 狇聚合酶、明胶、溴化乙锭、片段标记物、裂解液、缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、（、）、全

6、基因组扩增试剂盒。筛查鉴定方法 犇犖犃制备制备方法见附录。犇犖犃条形码基因片段扩增利用通用引物进行片段序列扩增，具体步骤见附录。序列分析测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段测序质量值小于 的序列，然后在生物条形码数据（）数据库或中国检疫性有害生物条形码数据库中比对分析。结果判定序列长度约为 。如果测定的序列与美国国家生物技术信息中心（）数据库中比对（，序列参见附录）相似度大于 时，可初步判定为小麦印度腥黑穗病菌，进一步鉴定按照标准 进行；如果测定的序列与条码数据库中（，序列参见附录）比对相似度大于 时，可初步判定为小麦矮化腥黑穗病菌，进一步鉴

7、定按照标准 进行。菌种或标本保存 样品保存分离到的检疫性腥黑粉菌菌种，转入马铃薯葡萄糖琼脂（）试管斜面培养基上，置于黑暗犛犖犜 条件下保存至少 个月，以备复验、谈判和仲裁。获取的菌瘿或菌瘿碎片等标本，密封保存，保存至少 个月，以备复验、谈判和仲裁。结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。犛犖犜 附录犃（规范性附录）犇犖犃制备犃 单个孢子犇犖犃获取菌瘿中冬孢子获取方法：用针刺破菌瘿，挑取不带植物组织的少许孢子，将这些孢子轻轻展布于载玻片上，在低倍镜下观察孢子是否

8、分散开，再将单个孢子挑起，直接转移到管的管盖中，在低倍镜下确认孢子是否已被成功放置。孢子悬浮液中冬孢子获取方法：用显微操作系统（或在倒置显微镜下人工操作）从孢子悬浮液中吸取孢子，所用毛细管孔径为 ，整个操作过程在检测器上进行监控，也可在显微镜下直接进行观察，确认孢子已被吸入毛细管内并被转移到管的管盖内。用破壁针对放置在管盖中的孢子实施破壁：在 低倍镜下用破壁针头轻轻挤压孢子，促使孢子壁破裂，使孢子中的核酸释放出来，在显微镜下检测孢子壁是否已经被压破。快速将反应混合液加到管盖中，振荡混匀，然后离心，置于冰上，振荡后离心。用全基因组扩增试剂盒对单个孢子进行扩增，扩增产物作为原始。犃 孢子培养物犇犖

9、犃提取犃 孢子萌发挑取冬孢子，置于水琼脂培养基上，、每日连续光照 条件下培养，解剖镜下检查萌发情况。对萌发的孢子用接种针挑取置于培养基上，培养。犃 孢子培养物的核酸制备称取 培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉末。立即转移到的离心管中，加入 预热的裂解液（）提取液 ，置于水浴锅中 水浴 ，期间不断混匀。加入 酶，充分混匀，在 放置 。加入等体积的 饱和酚，充分摇匀，在 下离心 。取上清液，加入氯仿异戊醇（），在 下离心 。再取上清液，加入氯仿异戊醇（），在 下离心 。加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于 冰箱静置 ，在 下离心 。弃上清，

10、加入 乙醇 ，下离心，去上清，重复次。得到沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入 或无菌去离子水，充分溶解后，测量的纯度和浓度后置于 冰箱中保存。注：该核酸制备也可采用提取试剂盒法。犃 犇犖犃纯度与浓度的测定用核酸蛋白分析仪测定的纯度与浓度，分别取得 和 处的吸收值，计算核酸的犛犖犜 纯度和浓度，计算公式如下：纯度 浓度 （）级溶液的 比值为 。犛犖犜 附录犅（规范性附录）扩增程序犅 犐 犜犛片段引物序列：犅 扩增体系及条件扩增反应的组成成分为：缓冲液，氯化镁，前后向引物各，犜犪 狇酶 ，模板，补充去离子水至。将反应体系混匀后置于仪中进行反应。反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病

11、菌的作为模板，阴性对照以不含有小麦印度腥黑穗病菌的作为模板，每个样品重复次。扩增反应程序为：预热，进入循环反应；变性，退火，延伸，共循环 次，循环后 延伸 。犅 琼脂糖凝胶电泳每个样品取的产物与的上样缓冲液混合均匀，并加到含有溴化乙锭（）的 琼脂糖凝胶的点样孔中，在 下进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统中观察、拍照，并保存照片。犛犖犜 附录犆（资料性附录）参考序列片段犆 小麦印度腥黑穗病菌犐 犜犛片段参考序列 犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪犻 狀犱 犻 犮 犪狊 狋 狉 犪 犻 狀 犆 小麦矮化腥黑穗病菌犐 犜犛片段参考序列 犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪犮 狅 狀 狋 狉 狅 狏 犲 狉 狊 犪 犛犖犜 书 书 书犛犖犜 参考文献，犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪犻 狀犱 犻 犮 犪 ：，：，：，：，：，：，犜犖 犛书号：定价：元