SN∕T 4877.8-2017 基因条形码筛查方法 第8部分：检疫性炭疽菌(出入境检验检疫).pdf

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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 基因条形码筛查方法第部分：检疫性炭疽菌犇犖犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犻 狀 犵狊 犮 狉 犲 犲 狀 犻 狀 犵犿犲 狋 犺 狅 犱犘 犪 狉 狋：犙狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犮 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犽 犪 犺 犪狑犪 犲 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言 基因条形码筛查方法分为 个部分：第部分：检疫性棒形杆菌；第部分：检疫性黄单胞菌；第部分：检疫性植原体；第部分：检疫性茎点霉；第部分：检疫性拟茎点霉；第部分：检疫性嗜酸菌；第部分：检疫性轮枝菌；第部分：检疫性炭疽菌；第

2、部分：检疫性腥黑粉菌；第 部分：检疫性疫霉。本部分为 的第部分。本部分按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、高瑞芳、王颖、史亚千、汪莹、段维军、向才玉、潘广、王红英、谢晓露。犛犖犜 基因条形码筛查方法第部分：检疫性炭疽菌范围 的本部分规定了咖啡浆果炭疽病菌犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犽 犪 犺 犪狑犪 犲条形码筛查中序列

3、的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于进境植物及植物产品中咖啡浆果炭疽病菌的条形码的筛查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。犇犖犃条形码犇犖犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犲生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的片段。甘油醛 磷酸脱氢酶犵 犾 狔 犮 犲 狉 犪 犾 犱 犲 犺 狔 犱 犲 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲犱 犲 犺 狔 犱 狉 狅 犵 犲 狀 犪 狊 犲

4、；犌犃犘犇犎糖酵解反应中的一个酶，分子量 ，为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达。在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定。咖啡浆果炭疽病菌的基本信息英文名：学名：犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犽 犪 犺 犪狑犪 犲 异名：犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿犮 狅 犳 犳 犲 犪 狀 狌犿 狏 犻 狉 狌 犾 犪 狀 狊（，）分类学地位：真菌界（），无性型真菌（），炭疽菌属（犆狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌犿）。方法原理使用基因作为咖啡浆果炭疽病菌的条码基因，通过对检测对

5、象的进行扩增及产物测序后，利用 核酸数据库比对，根据序列相似度筛查物种。犛犖犜 仪器设备和试剂 仪器设备超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、低温冰箱、扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。试剂氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、乙醇、无水乙醇、饱和酚、犜犪 狇聚合酶、明胶、溴化乙锭、片段标记物、裂解液、缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、（、）。筛查鉴定方法 犇犖犃制备制备方法见附录。犇犖犃条形码片段犘犆犚扩增利用基因的通用引物进行基因序列扩增，具体步骤见附录，测序。序列分析测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段

6、测序质量值小于 的序列。利用美国国家生物技术信息中心（）在线数据库中比对基因序列（：）。结果判定序列长度约为 ，序列与美国国家生物技术信息中心（）数据库中（）比对相似度大于 时，即可筛查初步判定为咖啡浆果炭疽病菌，咖啡浆果炭疽病菌的基因参考序列参见附录。进一步鉴定按 进行。菌种保存 样品保存分离到的咖啡浆果炭疽病菌菌种，转入麦芽提取物琼脂（）试管斜面培养基上，置于黑暗条件下保存至少 个月，以备复验、谈判和仲裁。结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。犛犖犜 附

7、录犃（规范性附录）犇犖犃制备犃 核酸制备称取 培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉末；立即转移到的离心管中，加入 预热的裂解液（）提取液 ，置于水浴锅中 水浴 ，期间不断混匀；加入 酶，充分混匀，在 放置 ；加入等体积的 饱和酚，充分摇匀，在 下离心 ；取上清液，加入氯仿异戊醇（），在 下离心 ；再取上清液，加入氯仿异戊醇（），在 下离心 ；加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于 冰箱静置 ，在 下离心 ；弃上清，加入 乙醇 ，下离心，去上清，重复次；得到沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入 或无菌去离子水，充分溶解后，测量的纯度和浓度后置于

8、冰箱中保存。注：该核酸制备也可采用提取试剂盒法或法等。犃 犇犖犃浓度及纯度测定用核酸蛋白分析仪测定的纯度与浓度，分别取得 和 处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：纯度 浓度 （）级溶液的 比值为 。犛犖犜 附录犅（规范性附录）扩增程序犅 引物序列：犅 扩增体系及条件扩增反应的组成成分为：缓冲液，前后向引物各，犜犪 狇酶 ，模板，补充去离子水至。将反应体系混匀后置于仪中进行反应。反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有咖啡浆果炭疽菌的作为模板，阴性对照以不含有咖啡浆果炭疽菌的作为模板，每个样品重复次。扩增反应程序为：预热，进入循环反应；变性，退火，延伸，共循环 次，循环后 延伸。犅 琼脂糖凝胶电泳每个样品取的产物与的上样缓冲液混合均匀，并加到含有溴化乙锭（）的 琼脂糖凝胶的点样孔中，在 下进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统中观察、拍照，并保存照片。犛犖犜 附录犆（资料性附录）犌犃犘犇犎片段参考序列序列号（）犛犖犜 参考文献 ，：，（）？，犛犖犜