NY∕T 3166-2017 家蚕质型多角体病毒检测实时荧光定量PCR法(农业).pdf

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1、ICS 07.080 B 47 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3166一2017家蚕质型多角体病毒检测实时荧光定量PCR法Detection of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus-Real time PCR method 2017-12-22发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出。本标准由全国桑蚕业标准化技术委员会归口(SAC/TC437)。NY/T 3166-2017 本标准起草单位:江苏科技大学、中国农业科学院蚕业研究所、农业部

2、蚕桑产业产品质量监督检验测试中心(镇江)、苏州大学、西南大学、华南农业大学。本标准主要起草人:吴萍、郭锡杰、陈涛、贡成良、潘敏慧、李龙、孙京臣。I NY/T 3166-2017 家蚕质型多角体病毒检测实时荧光定量PCR法1 范围本标准规定了家蚕质型多角体病毒CBombyxmori cytoplasrnic polyhedrosis virus)的实时荧光定量PCR检测方法。本标准适用于家蚕中肠组织中.2 规范性引用文件3 缩略语4 原理5 试剂与设备5.1 试剂与耗材除另有规定外，所用生用超纯水。提取RNA所用试剂酶污染。5.1.1 RNA提取试剂。5.1.2 一氯甲烧。5.1.3 异丙醇。5

3、.1.4 75%乙醇。5.1.5 DEPC。5.1.6 cDNA合成试剂盒。5.1.7 荧光定量PCR试剂盒。日期的版本适用于本文脱氧核糖核6682一级水要求并经灭菌或采配制，分装的容器应无RNA1 NY/T 3166-2017 5.1.8 无RNA酶污染的枪头和离心管。5.2 主要仪器设备5.2.1 实时荧光定量PCR仪。5.2.2 紫外分光光度计。5.2.3 高速冷冻离心机。5.2.4-200C冰箱和-800C冰箱。5.2.5 组织研磨器或研钵。5.2.6 微量加样器。6 样晶的采集采集家蚕中肠组织(0.1 gO.5 g)后迅速放人液氮中，再转移至一800C冰箱保存。7 操作方法7.1 R

4、NA的提取7.1.1 将样品放人预冷的研钵中加人液氮，用研样将待检样品磨成粉末状(保持液氮不挥发干净)，分装到元RNA酶的1.5mL离心管中，每0.1g组织加1.OmL RNA提取试剂，样品体积应小于Trizol体积的10%，振荡混匀，室温(200C300C)温育10min,12 000 g，40C离心10min。7.1.2 将上清液转移到新的1.5mL离心管中，每1mL上清液中加人0.2mL三氯甲:皖0/5体积)，剧烈摇动15s，室温放置5min,12 000 g，40C离心15min;混合物分层，卧-lA位于上层水相。7.1.3 将上清液小心转移到新的1.5 mL离心管中，加人等体积预冷的

5、异丙醇(可在一200C冰箱放置20 rnin以上)，颠倒混匀10次，室温静置10min,12 000 g，40C离心10min，弃上清液，保留RNA沉淀。7.1.4加入75%乙醇(DEPC7l配制)，1.0mL RNA提取试剂加人1.0 mL 75%乙醇，轻轻混匀，7500 g，40C离心5min，弃上清液。7.1.5 将RNA沉淀置于室温下自然风干5min 10 min，用30L40L的元RNA酶超纯水常温溶解RNA。7.1.6 利用紫外分光光度计测定RNA溶液的光密度值。当A260/A280值为1.902.05时，提取的RNA质量符合PCR的检测要求。剩余RNA置于一800C冰箱保存备用。

6、7.2 cDNA的合成以7.1中提取的RNA为模板，按照市售商品化试剂盒说明书反转录合成cDNA。以Takara公司生产的，货号为DRR047A试剂盒1)为例:首先进行去除基因组DNA反应，反应体系10L(反应液A)，其中，5X gDNA Eraser Buffer 2L，gDNA Eraser 1L，RNA 500吨，补加元RNA酶超纯水至10L终体积。420C反应2min。然后进行反转录反应，反应体系20L，其中，5X Primer Script Buffer 4 L、PrimerScript RT Enzyrne Mix 1 1L、RTPrimer Mix 1L、反应液A10L，补加元R

7、NA酶超纯水至20L终体积。反应条件:37C15 min,850C 5 s。反转录合成的cDNA置于一200C冰箱备用。7.3 实时荧光定量PCR检测7.3.1 引物序列2 正向引物:5一ATACAAGGTTGGCATTTCAGA-3;反向引物:5-ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT-3 0 荧光定量PCR产物信息参见附录A。1)该试剂盒是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。NY/T 3166-2017 7.3.2 对照设置阳性对照:含有经7.3.1引物扩增的BmCPV多角体蛋白基因片断的重组质粒DNA，质粒拷贝数不低于1.OX103。

8、阳性质粒制备方法参见附录Bo阴性对照:按7.1、7.2制备的健康家蚕中肠组织的cDNA。空白对照:超纯水。7.3.3 PCR反应体系反应体系20L:2X SYBRPrernix Ex Taq1M 10L，10mol/L正、反向引物各0.4t-tL，cDNA模板1L，超纯7)(8.2L。反应程序:950C预变性3min,950C 15s,60oC 1rnin，共40个循环。每个样品应重复3次。可按照其他市售商品化试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应。7.3.4 PCR反应质量控制扩增反应结束后，阳性对照出现典型的扩增曲线，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直或低于阳性对照荧光值的15%，表明反应体系工

9、作正常。否则，表明PCR反应体系不正常，需重新检测。8 结果判定在PCR反应体系正常工作的前提下，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。阔值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。判定规则如下:a)待测样品检测Ct值小于或等于30，判定该样品检出家蚕质型多角体病毒。b)待测样品检测Ct值大于或等于35，判定该样品未检出家蚕质型多角体病毒。c)待测样品检测Ct值大于30且小于3 5，应重新做PCR扩增，如重复实验结果出现典型的扩增曲线，Ct值仍然大于30且小于35，判定该样品疑是感染家蚕质型多角体病毒。3 NY/T 3166-2017 附录A(资料性附录)荧光定量PCR产物相关信息A.1 检测基因A.2

10、 4 附录B(资料性附录)阳性质粒的制备NY/T 3166-2017 B.1 以感染BmCPV的家蚕中肠组织的RNA为模板，反转录合成cDNA。操作方法同7.2。B.2 以反转录合成的cDNA为模板，用正向引物和反向引物扩增目的基因片段，PCR反应体系25L:10XPCR缓冲液2.5L，dNTPs(各10mM)O.5L，正、反向引物00mol/U各O.6L，cDNA模板1.0 L，Taq酶(5U/UO.5L，灭菌水19.3L。反应条件为:940C2 min;940C 30 s,580C 40 s,720C 40 s,30个循环;720C延伸10mino反应结束后，取5LPCR产物在2%的琼脂糖

11、凝胶上进行电泳分析。B.3 PCR产物经电泳鉴定后，按试剂盒说明书进行胶回收纯化目的片段，将目的片段与克隆载体连接，将其转化感受态细胞，提取重组质粒并进行测序验证。B.4 阳性质粒用碱裂解法进行提纯，根据紫外分光光度计测定OD260的值计算质粒浓度，按式(B.1)计算质粒拷贝数。c=NAX丘.(B.1)J 式中:C 质粒拷贝数，单位为每毫升质粒拷贝数(个/mL);NA-一一阿伏伽德罗常数，通常表示为6.02X 1023，单位为每摩尔物质的微粒个数(个/mol)(copies/mol);一一质粒浓度，单位为克每毫升(g/mL);-一质粒平均分子量，单位为克每摩尔(g/mol)。5 toNlSSHMZ 中华人民共和国农业行业标准家蚕质型多角体病毒检测实时荧光定量PCR法NY/T 3166-2017 长中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*争等印张0.75字数15千字2018年5月北京第1次印刷争等开本880rnrnX1230rnrn 1/16 2018年5月第1版书号16109 4377 定价18.00元*版权专有侵权必究举报电话(010)65005894