NY∕T 3639-2020 中华猕猴桃品种鉴定 SSR分子标记法(农业).pdf

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1、ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3639-2020 中华狲猴桃品种鉴定SSR分子标记法Identification of Actinidia chinensis cultivars using SSR markers method 2020-07-27发布2020-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3639-2020 目次前言.H 1 11也ff，J2 规范性引用文件.3 术i含辛11定义4 原理5 仪器设备及试剂-6 溶液配制7 引物相关信息及使用-.8 参照品种及其使用9 操作程序.,.,.2 10 判定方法.附录A(规范性

2、附录主要仪都设备及试剂附录B(规范性附录)溶液配11，卜。附录C(规范性附录)核心引物名单及序列附录D(资料性附录)核心引物相关信息.10 附录以资料性附录)参照品种名单及来源.11 I NY/1 3639-2020 JI NY/T 3639-2020 中华狲猴桃晶种鉴定SSR分子标记法范围本标准规定了利用简单重复序列(SimpleSequcncc Repcats,SSR)分子标记进行中华Jl猴桃Actin凶chillensisPlanchon，包括中华狲猴桃原变利I(Act口lidiachille川isPlanch.var.cl川咱们Isis)和美眯狲猴桃变利I(Jct川idiachinen

3、sis Planch.var.且岳阳帽霄哼?吧v叫屹，)雌性品种鉴定的术fi.和定义、原理、仪器设备及试剂、溶液配制、引物相关iOd雄用飞参照品种及其;厨3蜘l;f程序和l步1)定方法。本标准适用于2 下列文凡是不注日期的引NY/T 2351 NY/T 2594 3 3.1 核心引物品种鉴定3.2 待;到样品4 原理简单重复序列能不同。针对每个Polymerasc chain 同，经过扩增产生不同因此，根据SSR位点的多态性，5 仪器设备及试剂见附录Ao6 溶液配制见附录B.7 号|物相关信息及使用寻|物名单及序列见附录C，引物等位变异等相关信息参见附录Do8 参照品种及其使用本文件。参照品种

4、的名称及来源参见附录Eo在进行待测样品等位变异检测时，应同时包括相应参照品利:的NY/T 3639-2020 PCR扩增产物的检测。注1.同名称不同来源的参!商品种的某一位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参Jm品种时，应与原参照品种核对，确认无误后使用。注2:对于附录E中未包括的等位变异，应按本标准方法，通过使用阶认分析仪与参照品种同时进行检测确定其大小.9 操作程序9.1 样晶制备试验样品为中华狲猴桃的J嫩nl片，每份样品中至少随机灿收3个单株，进行混样分析。当一致性结果较差时，进行单独样分析。9.2 DNA提取a)勒i驭中华狲猴桃幼嫩叶片0.25g，放入-20C预冷的研钵中，加入

5、液氮迅速研磨多次，至粉末状后，立即装入2mL离心管巾，依次加入1.5 mL预热(70C)的2%CTA提取缓冲液、45L仕硫基乙醉，充分挤匀。b)65C恒j6ft水浴1h，期间每隔10min翻转离心管数次。12000r/min，4C离心15min.c)llR上清液，力11入等体积的氯仿:异戊膨(24:l，V/V)，轻轻颠倒混匀，于常温下静置10min,12000 r/min，4C离心1 5min.d)取上清液，加入等体积的氯仿，颠倒混匀，12000r/min，4C离心15min.c)1段上清液，加入2倍体积20C预冷的元水乙醉，颠倒混匀，在一20C下静宜30min:12 000 r/min，4C

6、离心10min，弃上清液。f)沉淀的DNA用75%乙醇浸泡沾一洗沉淀2次，弃乙醉，离心管置于通风橱中风干，将沉淀物溶解于200L双蒸水中，加lL10 g/L的RNascA，37C泪浴30min,-20C保存备用。g)用75%乙醉浸泡清洗沉淀2次，风干，将沉淀物榕解于200L双蒸水中。h)利用NanoDrop分光光度计检视DNA浓度，将DNA浓度稀释到50ng/mL左右，-20C保存备用。注，以上为推荐的DNA提取方法，其他达到IJPCR扩增质盐要求的DNA提取方法均适用.9.3 PCR扩增9.3.1 反应体系PCR反应体系为20L:lOXBufcr(含Mg2+)2.0 IL,2.5 mmoi/

7、L dNTP5 2.0L，样品DNA2.0 L，EX Taq 酶(5U/LJO.2L，正向和反向引物00mmoi/L)各1.0L，双蒸水11.8L。利用毛细管电泳荧光检测n才使用荧光标记引物。引物的荧光染料种类参见i附录D.9.3.2 反应程序94C预变性min:94C变性305,54C 56C(根据附录D推荐的引物退火温度设定)退火305,72C延伸455，共35个循环:72C延 II10 min:扩增产物4C保存。9.4 PCR产物检测9.4.1 变性聚丙烯酿胶凝胶电泳(Polyacrylamidegel electrophoresis,PAGE)9.4.1 1 清洗玻璃板将玻璃板清洗干净

8、，用去离子水冲洗后晾干。用元水乙回事擦洗2遍，1吸水纸擦干。在i主板上涂上O.5 mL亲和硅炕工作液，带凹糟的短板上涂0.5mL剥离硅烧工作液。操作过程中防止2块玻璃板互相污染。9.4.1.2 组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并HJ水平仪讲l平。9.4 1.3 制胶在60mL 6%P八GE胶液中分别IJO人600L10%(1过硫酸锁和60LTEMED，轻轻混匀后，制)段。制胶过程中防止出现气泡。待l应液充满破硝板夹层，将0.4mm厚盗鱼齿梳齿平齐端向里轻轻插入胶液约0.cm.J民液在室rJ下聚合2h以上。!饺聚合后，清理胶板表丽溢出的j皮液，轻轻拔tH梳子，用水消洗干净备用。NY/T

9、3639-2020 9.4.1.4 电泳消除凝胶顶端气泡和l聚丙烯MJ按碎片。每一个)111样孔点人2L-4L扭附产物和2L6X Load ing Buffcr，在l践板两侧点人DNAMarkcr.除待测样品外，还应同时加入参照样品的扩增产物。在30W-40 W恒功率下电泳，使凝l皮温度保持在约50C.1l!.iiC 1.5 h-2.0 hC电泳时间取决于扩增片段的大小范Rj)。注:J(.j.丰功率大小段报也泳槽的规格型号和l实验室室温设o9.4.1.5 银染a)i洗。取I:ll J皮板，放入水洗f室中，凡l蒸f1f7Kiji洗2次，每次漂洗30S;b)染色.从水洗框中取:JJ皮板c)，l洗:

10、Jjj(:J:J.皮板，d)9.4.2 示例1分别为110和位变异数据应为示191)2:参照样品布frf诺号相应的数据分别为门该位点上的等位变异数据应9.4.2 4 结果记录.当条带类型完96孔饭孔95C变性5，使用片段分lJ 121，则待面l样品在对于二倍体品种，纯合位点的基因型数据记录为X/X，杂合位点的基因型数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上两个等位变异，小片段敛据在前，大片段数据在后;缺失位点基剧型数据记录为0/0.对于四倍体和六倍体品种，直接记录在该位点上的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后.不问片段大小用/间隔。示例1一个二倍体品利在UDK96-001位点上有l个等位

11、变异，大小为285，J月1该品种在该位I;仁的等位变异敛lkl记录为285/285.示例2:一个四倍体品种在UDK96-001位点上有4个等位变异.大小分别为263、273、281革11291，则该，fl，;Jtjqt该位点上的等位变异数据记录为263/273/281/291.示例3一个六俏体品种在UDK96-034位点上.I!示有6个等位变异，大小分别为168、174、188、198、202和21O，j!u该品事l在该位点上的等位变异数据记录为168/17-1/188/198/202/210.3 NY/T 3639-2020 10 判定方法10.1 结果统计对检测的位点逐一进行比较，统计总位

12、点数、差异位点数、元差异位点数、缺失佼点数、无法判定位点数等信息，位点差异悄况分为下列4事1，a)位点存在差异的，记录为有差异;b)位点完全相同的，记录元差异;c)位点数据也是失的，记录为缺失，d)位点显示无法判定的，记录为无法判定。10.2 判定方法对待泪样品和l对!t!品种以IItJ录C中的9对核心引物进行标记检测，将获得的待训品种等位变异数掘进行品种问比较或与数据库中品种比较，判定方法如下a)品种问差异位点数二2，判定为不同品种，b)品种间差异位点数=1，判定为近似品种;c)品种间差异位点数=O，IJ定为极近似或相同品种。差异位点小于2个位点时，按照NY/T 2351的规定进行111问鉴

13、定，以取终确定品种的异同。10 3 结果表述待视样品xxx与对1m品种YYY利用SSR分子标记法，采用一一一一检测平台，检测位点数为.差异位点数为-一一一一差异位点为一一一一一一判定为一一一一NY/T 3639-2020 附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂A.1 主要仪器设备及试剂A 1.1 高压灭菌锅A 1.2 ICR扩增仪A.1.3 电泳槽及配套的和j胶附件A.1.4 高压电;承仪A.1.5 DNA分析仪A.1.6 台式高速离心机A.1.7 凝胶成像系统或紫外透射仪A 1.8 水浴锅A 1.9 制冰机A.1.10 紫外分光光度计A.1.11 微量移液器A.1.12 水平摇床A.1.l3

14、 胶片观察灯A.1.14 电子天平(精确到0.01g)A.1.15 酸度计A.1.16 冰箱A2 主要试剂除非另有说明，在分析中均使用分析纯试剂。A 2.1 乙二胶囚乙酸二纳(EDTA-Na，21-1,0)A 2.2 三瓷甲基氨基甲皖(Tris)A 2.3 浓盐酸A 2.4 氢氧化纳A.2.5 去离子甲酷胶A.26皇酣蓝A.2.7 氯仿A 2.8 异戊醇A.2 9 甲叉双丙烯酿股A.2.10 丙烯酷胶A 2 11 棚酸A 2 12 亲和硅皖A 2.13 剥离硅蜕A.2.14 二甲基二氯硅烧5 NY/T 3639-2020 A.2.15 无水乙醇A 2 16 四甲基乙二胶(TEMED)A.2.1

15、7 过硫酸钱(APS)A.2.18 冰醋酸A.2.19 硝酸银A.2.20 甲隆A 2 21 十六烧基三甲基漠化钱(CI础)A.2 22 聚乙烯眈咯烧圆(PVP)A.2 23 缓冲液(含Mg+)A.2.24 4种脱氧核苦酸(A.2.25 Taq DNA A 226 SSR引物A.2.27 去离子7lA 2.28 LIZ A.2.29 A 230 A.2.31 6 B.1 DNA提取溶液的自己制DNA提取溶液的配置使用双蒸水.B.l.1 1 mol/L氢氧化纳溶液附录B(规范性附录)溶液配制称i驭40g氮氧化俐，浴于800mL 水中，冷却至室lil，后，定容至1000mLo B.l.2 o.5

16、mol/L Z:二肢四Z酸二锅溶液(pH8.0)NY/T 3639-2020 称II且186.1 g乙二l段四乙股二销拢，jm入800mL水，再加入20g氢氧化俐，搅拌。待乙二胶四乙自主二纳放完全溶解后，冷却至室l，0 f耳用氢氧化纳浴液(1mol/U准确调pl-I至8.0，定容至1000 mLo在103.4 kPa(1210C)条件下灭菌20mino B.l.3 O.5 mol/L盐酸(HCI)溶液盘Ijj(25 mL浓盐酸于烧杯中，jO入少量水稀释，混匀冷却至室温后，用玻璃栋引流至容ht瓶中，再加少量水消洗烧杯后用玻璃栋引流至容虱瓶中，反复儿次后，j1水定容至500mL，上下颠倒混匀后，转

17、到广口瓶中.B.1.4 1 mol/L三短甲基氨基甲烧盐酸溶液(pH8.0)称Ijj(60.55 g Tris碱溶于约400mL 水中，加盐殴济液(0.5mol/U询pH至8.0，加水定容至500mL，在103.4kPa(1 210C)条件下灭菌20mino B.1.52%(W/V)十六皖基三甲基漠化镀(2X口AB)溶ITli分别称i仅20 g十六;皖;Jil;三l:p，!i!化钱、81.816 g 函化例和20g 聚乙烯11比1恪炕酣浴于约700mL 水中，力rI入100mL=气短甲基氨基甲烧iik主溶液(1mol/L.11-1 8.0)和40mL乙二胶四乙酸二倒浴液(0.5mol/L,pI

18、-l 8.0)，j)l水定容至1000 mLo B.l.6 5 mol/L NaCI溶液称Ijj(292.2 g氧化俐，溶于750mL水中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，JJII水定容至1000 mL.在103.4kPa灭菌20mino B.2 PCR扩增溶液的配制PCR扩增相关浴液的配1111使用双蒸水。B.2.1 SSR召|物稀释开盖前l瞬时离心10s，按说明书分别配制前引物和后引物终浓度均100mol/L(I储存液，各JlUoIL力fI90L双蒸水至终浓度lO，mol/L的工作液。B.3 变性聚丙烯酷胶凝胶电泳相关溶液的配制变性聚丙烯脱j胶凝胶电泳相关榕浓的配制使用双蒸水.B.3.1 30%丙

19、烯酷胶溶液(W/V)分别称Ijj(290 g丙烯IlItJ按平1/10 g I:p又双丙烯航胶溶于约800mL 7(中，jm水定容至1000mL，虫子棕色瓶中40C储存.B.3.2 6%变性PAGE胶(年!v)量1驭16mL 30%的丙烯航l险，12mL5XTBE缓冲液、600mL 10%过硫酸钱(新鲜配I巾和60mL四l:p基乙二!跤，加水定容至60mLo 7 NY/T 3639-2020 B.3.3 亲和硅烧工作液l吸取1mL无水乙醉，力n入10L亲和硅;院和10L冰醋酸，混匀。B.3.4 剥离硅炕工作液量I农2mL的二甲基二，l(j硅炕，力n8 mL的三氯甲:院，1昆匀。B.3.510%

20、过硫酸锻溶液(W/V)称取0.1g过硫酸饺浴于1mL水中。B.3.6 10XTBE缓冲液分别称取108g三泾甲基氨基甲:烧和J55 溶液(0.5mol/U，加水定容至1000B.3.7 5 XTBE缓冲液量Jlll.500 mL的10XB.3.8 1 X TBE缓冲液8 800 mL 水中，1JO人37mL乙二胶四乙股二纳NY/T 3639-2020 附录C(规范性附录)核心引物名单及序列9对引物名单及序列见表C.10 表C.1 9对引物名单及序列习|物编号寻|物名称引物序列(5-3)101 UDK96-001 F,GtvTCGCGTtvTGATTGATGG R,GTTTCCCACTCTGCA

21、tvAGC 102 UDK96-015 F,CCGAGTCATGA TCGAGTTGA R,GGCTCtvCTTGGAGtvGTGG 103 UDK96-016 F,TlAGGTGAtvGACACACCACAC R,A TAtvCGTCATGGGCTCAGC 104 UDK96-026 F，CGC丁GACCAGATTCTGATGAR,TTGAAtv TCACTGAGCACAACC 105 UDK96-030 F,TCATGTTTGTGGrrGAGrGTG R,AGCAATAAACTCtvGCGCGT I咱6UDK96-034 F，TrATATGG下GCGGCATGCTAR,TGtvTGCAGA

22、AGGCtv丁CAG107 UDK96-040 F,TCGAGn ACCTAGCTACTCCGC R,CAAGGGAAGAAAATGTTGtvCC 108 UDK97-109 F,ATGACCT ATTGCCtvGTGGC R,nGTGTGTAC巳CACCACCC109 UDK97-114 F，GCCAnCtvGAACA1 1 1 1 11G R，TGGCTATATn寸GCAAGCCC9/T 3639-2020 核心引物相关信息见表D.L引物编JJ引物.r.称101 UDK96-001 102 UDK96-015 P03 UDK96-016 P4 UDK96-026 P5 UDK96-030

23、P06 UDK96-031 107 UDK96-040 I骂08UDK97-409 109 UDK97-414 10 附录D(资料性附录)核心冒|物相关信息表D.l核心引物相关信息t位和荧光i且火温度:c56-FAM 56 56-FAM 54 56-FAM 56 56-FAM 56 56-FAM 56 5I-IEX 56 5I-IEX 56 51-IEX 56 5I-lEX 54 等位变异.bp参!，W，f311257 紫香271 主阳285 I-Iort 16A 291 在h#4号106 金自l1H 主II是l116 金农200 萦吞204 娘有4146 生i阳、金农150 金魁160 华优

24、103 京香115 中i甘苦4号131 I-Iort 16A 168 和平1号182 布鲁诺192 金农198 军i;t，直202 豫1世1号2H 想吞132 金农H2 布鲁谛110 主11:1118 索香120 金魁128 京香116 布岱i27124 I-I.I.Gold 138 桂拍*1号NY/T 3639-2020 附录E(资料性附录)参照品种名单及来源参照品种名单及来源见表E.10 表E.l参照品种名单及来源编号参照品种来源所属类型l 金魁1-1-1网农业科学院郑州果树研究所央味称猴桃2 翠有二1网农业科学院郑州果树研究所;E咪狲:猴桃3 布鲁诺11再农业科学院郑州某树研究所荣咪狲猴

25、桃4 和平1号湖北省农业科学院果树茶叶研究所尖昧狲猴桃5 华优湖北省农业科学院果树茶叫研究所巾华称猴桃6 金阳湖北省农业科学院果树茶叫研究所中华狲猴桃7 金农湖北省农业科学院果树茶叶研究所中华弥猴挑8 素香湖北省农业科学院果树茶叫研究所1华狲猴桃9 H二部4号湖北省农业科学院梨树茶叫研究所1 i/，狲猴桃10 琼浆1 1农业科学院郑州果树研究所1华称猴桃11 豫虫l号1 1叫农业科学院郑州果树研究所巾华jjj似桃12 Hala Gold 湖北省农业科学院果树茶叶研究所1华拍:猴桃13 Hort 16A 1 1农业科学院郑州果树研究所1华捎:猴桃14 缸阳1同农业科学院郑州果树研究所巾华协猴桃11 ONON-白白白白HhFZ中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子!占衔18号楼)网也1:)北京印刷一厂印刷l新华书店北京发行所发行各地新华书店经销4略奇峰奇峰(邮政编码100125关印张I字数20千字2020年10月北京第l次印刷 开本880mmX1230mm 1/16 2020年10月第1版书号16109 8214 定价，24.00元奇峰版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 NY/T 3639-2020