GA∕T 1638-2019 法庭科学 尿液中地西泮等四种苯骈二氮杂？类药物及其代谢物检验 气相色谱-质谱法(公共安全).pdf

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1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 尿液中地西泮等四种苯骈二氮杂类药物及其代谢物检验 气相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for four benzodiazepines including diazepam and their metabolites in urine samplesGC-MS -发布-实施 中华人民共中华人民共和国公安部和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。请注意本文件的某些

2、内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。本标准起草单位：上海市公安局物证鉴定中心、公安部物证鉴定中心。本标准主要起草人：汪蓉、张玉荣、梁晨、于忠山、王芳琳。GA/T 1 法庭科学 尿液中地西泮等四种苯骈二氮杂类药物及其代谢物检验 气相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学尿液中地西泮、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑及其代谢物N-去甲基地西泮、替马西泮、-羟基三唑仑、-羟基阿普唑仑和-羟基咪达唑仑的气相色谱-质谱（GC-MS）定性检验方法。本标准适用于法庭科学尿液中地西泮、

3、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑及其代谢物N-去甲基地西泮、替马西泮、-羟基三唑仑、-羟基阿普唑仑和-羟基咪达唑仑的定性分析。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 以空白样品作对照，地西泮-D5或多沙普仑为内标，经液液萃取或固相萃取对尿液样品进行提取、净化并浓缩，或衍生化后，采用气相色谱-质谱法检测，以保留

4、时间、质谱特征碎片离子峰和相对丰度比作为定性判断依据。5 试剂及材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括：a）甲醇；b）苯；c）乙酸乙酯；d）二氯甲烷；e）氨水；f）吡啶；g）醋酸酐；h）碳酸钠/碳酸氢钠（体积比为3:1）缓冲液（pH值10.7）：称取碳酸钠10.6g溶于100mL水中，配成1.0mol/L碳酸钠溶液；另称取8.4g碳酸氢钠溶于100mL水中，配成1.0mol/L碳酸氢钠溶液；i）-葡萄糖醛酸苷酶；GA/T 2 j）标准溶液：1)1.0mg/mL 标准物质溶液：根据地西泮、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑标准物质纯

5、度和盐型换算后，各称取适量，用甲醇配制 1.0mg/mL 地西泮、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑标准物质溶液，密封，置于冰箱中 28保存。有效期 12 个月。或采用市售标准溶液；2)0.1 mg/mL标准工作溶液：移取1.0mg/mL标准物质溶液各1.0mL，用甲醇稀释至10mL，混匀，配制成浓度为0.1 mg/mL的标准工作溶液。密封，置于冰箱中28保存，有效期6个月；实验中所用其他浓度的标准工作溶液均由0.1mg/mL标准工作溶液用甲醇稀释得到；3)1.0mg/mL 代谢物标准物质溶液：根据 N-去甲基地西泮、替马西泮、-羟基三唑仑、-羟基阿普唑仑和-羟基咪达唑仑标准物质纯度和盐型换算后，各称

6、取适量，用甲醇配制1.0mg/mLN-去甲基地西泮、替马西泮、-羟基三唑仑、-羟基阿普唑仑和-羟基咪达唑仑标准物质溶液，密封，置于冰箱中 28保存。有效期 12 个月。或采用市售标准溶液；4)0.1mg/mL 代谢物标准物质溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质溶液各 1.0mL，用甲醇稀释至10mL，混匀，配制成浓度为 0.1 mg/mL 的代谢物标准工作溶液。密封，置于冰箱中 28保存，有效期 6 个月；实验中所用其他浓度的代谢物标准工作溶液均由 0.1mg/mL标准工作溶液用甲醇稀释得到；5)1.0mg/mL地西泮-D5（或多沙普仑）内标溶液：根据地西泮-D5（或多沙普仑）内标物质纯度和

7、盐型换算后，称取适量，用甲醇配制1.0mg/mL地西泮-D5（或多沙普仑）内标物质溶液，密封，置于冰箱中28保存。有效期12个月。或采用市售标准溶液；6)0.1mg/mL 地西泮-D5（或多沙普仑）内标工作溶液：移取 1.0mg/mL 标准内标溶液各 1.0mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀，配制成浓度为 0.1 mg/mL 的内标工作溶液。密封，置于冰箱中 28保存，有效期 6 个月；实验中所用其他浓度的内标工作溶液均由 0.1mg/mL内标溶液用甲醇稀释得到。注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。5.2 材料 材料包括：a）试管及具塞离心管等实验器材；b）pH 试纸：范围 114；c）

8、固相萃取柱：Oasis HLB固相萃取柱或等效固相萃取柱：使用前依次用甲醇、水活化。注：Oasis HLB柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。6 仪器和设备 仪器和设备包括：a）气相色谱-质谱仪：配有电子轰击源（EI）；b）电子天平；c）离心机；d）振荡器；e）微波炉；f）水浴锅；g）移液器。GA/T 3 7 操作方法 7.1 样品提取 7.1.1 游离组分的提取 7.1.1.1 液液萃取 移取尿液检材样品 2.0mL 于具塞离心试管中，加入内标物 500ng 地西泮-D5（或

9、多沙普仑），再加入碳酸钠/碳酸氢钠（体积比为 3:1）缓冲液 0.5mL，混匀，加入苯/乙酸乙酯（体积比 1:1）混合溶剂 5mL，振荡 5min，4000r/min 离心 5min，分离有机相，置于浓缩器上 60 C 浓缩至干，残留物用甲醇 100 L 溶解，供仪器分析。7.1.1.2 固相萃取 移取尿液检材样品 2.0mL 于具塞离心试管中，加入内标物 500ng 地西泮-D5（或多沙普仑），振荡，转移至活化好的固相萃取柱中，控制流速为 0.5 mL/min1.5mL/min，依次用 1mL 氨水/甲醇/水（体积比 2:5:93）混合溶液、1mL 甲醇/水（体积比 5:95）溶液淋洗，弃去

10、淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 1mL 二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，置于浓缩器上 60C 浓缩至干，残留物用甲醇100 L 溶解，供仪器分析。7.1.1.3 质控样品制备 取等量尿液空白样品一份于具盖离心管中，与检材平行操作，得到空白样品提取液供仪器检测。7.1.2 结合组分的水解和提取 7.1.2.1 水解 移取尿液检材样品 2.0mL 于玻璃具塞离心试管中，加入内标物 500ng 地西泮-D5（或多沙普仑），再加入缓冲液和-葡萄糖醛酸苷酶，混匀，进行水解（-葡萄糖醛酸苷酶使用说明参见附录A中A.1）。7.1.2.2 样品提取 水解后的样品按照 7.1.1 步骤操作后，

11、采用 7.1.2.3 衍生化。7.1.2.3 衍生化 在 7.1.2.2 样品提取后的残留物中，加入吡啶 50L 和醋酸酐 100L，振荡，置于微波炉中高火加热3min，置于浓缩器上，60C 空气（或氮气）流下浓缩至干，残留物用甲醇 100L 溶解，供仪器分析。7.1.2.4 质控样品制备 取等量尿液空白样品1份于具盖离心管中，与检材平行操作。7.2 仪器检测 7.2.1 仪器条件（气相色谱-质谱）以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：DB-5 柱（30m 0.25mm，0.25m）或等效色谱柱；注：DB-5 柱为 Agilent 公司产品的商品名称，给出

12、这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)色谱柱温程：100保持 1min，以 20/min 速率升温至 280，保持 20min；GA/T 4 c)进样口温度：260；d)传输线温度：280；e)离子源温度：230；f)载气：氦气；g)柱流量：1mL/min2mL/min；h)溶剂延迟：3min；i)进样方式：分流进样，分流比：5:150:1；j)质量扫描范围：40amu500amu；k)扫描方式：全扫描(SCAN)或选择离子监测(SIM)，选择离子参见附录 A 中表 A.1。7.2.2 进样 分别吸取各检材提取液、

13、空白样品提取液、内标工作液和标准工作溶液各1L，按7.2.1分析条件进样分析（如为药物对照溶液，可直接进样，如为药物代谢物，则需将代谢物对照品溶液吹干后经7.1.2.3衍生化步骤后进样)。8 结果评价 8.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准物质（或衍生液）一致（相对误差在 1%之内），且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物的质谱特征离子（不少于 3 个）与标准物质（或衍生液）一致，特征离子丰度比与浓度接近的标准物质（或衍生液）相比，相对偏差不超过表 1 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物，相关质谱图参见附录 A 中图 A

14、.1图 A.12。表 1 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50%2050 1020 10%最大允许相对偏差 10 15 20%50%8.2 阴性结果评价 检材样品中未出现与目标物一致的色谱峰，且检材样品中出现与内标物（衍生后内标物质）一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。方法检出限见附录 A.1。GA/T 5 附 录 A（资料性附录）相关资料及质谱图 A.1 方法检出限 本方法的检出限：地西泮、咪达唑仑、N-去甲基地西泮、替马西泮、-羟基咪达唑仑均为50ng/mL，三唑仑、阿普唑仑、-羟基三唑仑、-羟基阿普唑仑均为100ng/mL。A.2-葡萄糖醛

15、酸苷酶使用说明 尿样中苯骈二氮杂类药物代谢物的水解可以用不同酶型的-葡萄糖醛酸苷酶。不同酶型的-葡萄糖醛酸苷酶的使用条件，如配制方法、使用量、水解温度及酶解时间、缓冲溶液和 pH 值等不一定相同。因此应按照产品出厂说明书进行配制和使用。A.3 关于样品处理步骤的说明 检测尿样中地西泮、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑、N-去甲基地西泮不需水解和衍生化，可以直接提取检测；替马西泮、-羟基三唑仑、-羟基阿普唑仑和-羟基咪达唑仑由于存在较多的葡萄糖醛酸结合物，直接提取效果不佳，应经过水解后提取，其中-羟基三唑仑、-羟基阿普唑仑和-羟基咪达唑仑必须经衍生化后进样，替马西泮可以不衍生化直接进样，也可以衍生化后

16、进样。A.4 保留时间及质谱特征离子 四种苯骈二氮杂类药物及其代谢物和内标的保留时间、质谱特征离子见表 A.1。表A.1 四种苯骈二氮杂类药物及其代谢物和内标的保留时间、质谱特征离子表 序号 药物名称 参考保留时间 min 特征碎片 1 地西泮-D5 11.29 261，289，287 2 地西泮 11.30 256，283，221 3 N去甲基地西泮 11.78 242，269，235 4 咪达唑仑 12.32 310，325，163 5 替马西泮 12.33 271，300，257 6 替马西泮AC 13.07 271，300，342 7-羟基咪达唑仑-AC 14.77 310，340，3

17、83 8 多沙普仑 15.19 100，378，347 9 阿普唑仑 16.22 279，308，204 10 三唑仑 17.76 313，342，238，279 11-羟基阿普唑仑AC 19.15 323，366，271 12-羟基三唑仑AC 22.38 357，400，137 GA/T 6 A.5 相关质谱图 四种苯骈二氮杂类药物及其代谢物衍生化产物及内标相关质谱图见图A.1图A.12。(mainlib)Diazepam30609012015018021024027030005010015273951637782891101171381651771932052212412492562682

18、83NONCl 图 A.1 地西泮(mainlib)Triazolam408012016020024028032036005010015273951637588102137150163177203238279288313342NClNNClN 图 A.2 三唑仑 (mainlib)Alprazolam30609012015018021024027030005010015273951637789102116137163177204219245253279293308NClNNN 图 A.3 阿普唑仑 GA/T 7(mainlib)Midazolam306090120150180210240270

19、30033005010015273951 6375111128142163181 195222230249283297310325NClNNF 图 A.4 咪达唑仑 (mainlib)Nordazepam3060901201501802102402700501001828 3951637689103116138151163178193207214235242253270NHClON 图 A.5 N-去甲基地西泮 (mainlib)Temazepam30609012015018021024027030005010052637791104118140148165177193214228243256

20、271284300NClONOH 图 A.6 替马西泮 GA/T 8 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 01 2 01 4 01 6 01 8 02 0 02 2 02 4 02 6 02 8 03 0 03 2 03 4 005 0 01 0 0 01 5 0 02 0 0 02 5 0 03 0 0 03 5 0 04 0 0 04 5 0 05 0 0 05 5 0 06 0 0 06 5 0 07 0 0 07 5 0 08 0 0 08 5 0 09 0 0 09 5 0 0m/z-丰度#2 2 0 7 8 7:T e m a z e p a m a c e t a t e2

21、7 1.04 3.03 0 0.07 7.01 6 5.01 9 3.01 0 4.02 2 8.01 4 0.03 4 2.01 5.0 图 A.7 替马西泮(醋酸酐衍生化)2 0 4 0 6 0 8 01 0 01 2 01 4 01 6 01 8 02 0 02 2 02 4 02 6 02 8 03 0 03 2 03 4 03 6 03 8 04 0 005 0 01 0 0 01 5 0 02 0 0 02 5 0 03 0 0 03 5 0 04 0 0 04 5 0 05 0 0 05 5 0 06 0 0 06 5 0 07 0 0 07 5 0 08 0 0 08 5 0

22、09 0 0 09 5 0 0m/z-丰度#2 6 5 1 3 8:.a l p h a.-H y d r o x y t r i a z o l a m,a c e t a t e3 5 7.04 3.07 5.01 3 7.01 7 7.04 0 0.02 3 9.03 2 9.03 0 1.02 7 3.01 0 3.01 5.02 0 5.0 图 A.8 -羟基三唑仑(醋酸酐衍生化)406080100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 44002000400060008000100001200

23、01400016000180002000022000240002600028000300003200034000360003800040000m/z-Abundanc eSc an 2843(19.440 mi n):H6.D3234327136677295204243177137103157224386446341415 图 A.9 -羟基阿普唑仑(醋酸酐衍生化)GA/T 9 4 06 08 01 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0 4 2

24、0 4 4 001 0 0 0 02 0 0 0 03 0 0 0 04 0 0 0 05 0 0 0 06 0 0 0 07 0 0 0 08 0 0 0 09 0 0 0 01 0 0 0 0 0m/z-A b u n d a n c eS c a n 2 1 3 7 (1 5.3 3 0 m in):Y X D Z.D3 1 03 4 03 8 34 32 9 22 5 79 57 51 6 32 2 11 8 11 2 82 0 32 3 94 4 63 6 54 0 1 图 A.10 -羟基咪达唑仑(醋酸酐衍生化)(mainlib)2-Pyrrolidinone,1-ethyl-4-

25、2-(4-morpholinyl)ethyl-3,3-diphenyl-406080100120140160180200220240260280300320340360380 0 50 10042567091100113129152165178194203219234248264278291302319 333347360378NNOO 图A.11 多沙普仑(version 2.4)Diazepam-d5405060708090100110120130140150160170180190200210220230240250260270280290300 0 50 10042545863687580828996102112125131138155170181198210226233246252261272281287NONDDClDDD 图A.12 地西泮-D5 _