NY∕T 3785-2020 葡萄扇叶病毒的定性检测 实时荧光PCR法(农业).pdf

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1、ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/1 3785-2020 葡萄扇叶病毒的定性检测实时荧光PCR法Qualitative detection of grapevine fanleaf virus-Real time fluorescence PCR method 2020-11-12发布2021-04-01实施二号中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3785-2020 前NY/T 3785-2020 葡萄扇叶病毒的定性检测实时荧光PCR法范围本书IfIJ(H萄t-f中和l离休3居民1材料1份j稍j，j111出415的实1J.j生U;PCl检测Mk。-1

2、吨，I!UJl川刊ti萄t;f;j开11肉体策的(tjJf.o帽翼事蜀，回灿灿dl扮圳IJ0 2 规范性引用文件、15(11)(川、文件.昵附灿昂地pl川儿A占4、t11 JWIjlJ+1 Gllj丁66823 缩赂i吾下纠纷icJ)N,PCR，段DN八j悦M MI.V,dNTPs,4。l二PC，JN Tm/INsc，Tri到I-JCI4 原理5 仪器与设备5.1 JJI.t尖);PCR检测仪。5.2 iI1微+;t紫外核阪蛋jJ检由1)仪。5.3 Il!.子大、|:!t1甘为0.01go 5.4 i:j J革冷冻FI心机，转速在12000r/min以L5 5们i.ill1-，JJ浴。5.6

3、微rIC移液沁:ILt!r分jJrJ为O.11.-2.5 11.、0.5td,-IO 11.、51 1.-20 Id.、101，1.-1001.、2011.-200 11.、1001,1.-1 000 1,1.0 NY/1 3785-2020 6 试剂与耗材|除另平TJJ!定外，所川试开1均为分析纯，;iA创刊71符合GBI丁6682中一级水的规格。6.1 M MLV反t)KNfJ浓度为200U/1d，。6.2 dNTPs，浓度为2.5mmol/L。6.3 DEPC;I)r DEPC 100 L.)111双掠水至100Il1L,t匀.室混过夜，121.C:jJf灭的15min.洼111+I)/

4、:I气、有剌激tl刷，:ti.1叫此处J1!II.II，i!1油风I!.I迸行.也可购买商品化的DEPC处J11l7/z.6.4 10%二炕基JUl氮I!i俐，;f;年月k5.00日二炕基JUl氨酸例.I谷丁二DEPC处理的灭的双;if:水中容军50 Il1L。6.5 随机寻1itlJ,吁有6个liliJMI甘lli机序列。6.6号1itlJ 5 71物5TCTAGGG丁IC八GAAGGACCG-3;:I引物，5AGGAGGAGGCGAAGGAATC-3.6.7 裂仰7在:分到1称i仅f;k(n主l脱H.20 g、阿il主俐1.64 g、乙二j胶阿乙酸。.74g、II主但19.80 g、发乙吓

5、;lIltl恪炕同1(130)2.50 g，括i干DEPC处且H的灭的;)(!1;中.定容至100mL。6.8 去蛋l二11I支分川利ll，Mi吼网友W:l5.IO g、丁risHCI 0.34 g，前年二rDEPC处理的灭两双茶水，定科?j550 ml，)1II人Jl;水乙盹(50时，。6.9 以:t液:分)JI丰收(A化例。10g、Tri什ICI0.03 g,H-I IJEPC处理的灭菌双蒸71ii二容罕20ml.，)1II人无水乙眠(801l11.。6.10 反转法泌合液-05X反转;LE反应缓冲液、dNTP挝、RNascjl)It;，剂和1M-MI.V反转iE酶，配iliI1HI、!A

6、.l咐-*/0 6.11)光PCR扩JrY1tM1斗液介1T2XSYI:lR G，巳enqPCI混合反应液、5号|物和13习|物，配1;11H去.!h.1咐SRA。6.12 RN八.JitJ&1败问I村放套价。6.13 走)(;PCR检测IjJTI 8 1m竹和IX子。7 操作步骤与方法7 1 样品击J备叶片样JJIe垠tf:i则仍I萄IIj-J:，川火I泊双茶水冲洗、UE纸擦拭千净。枝条样AItl将1j检枝条似JIii5 cm-IO cm.币i取其切JJi.;，j组织，)k人样Alf袋中。组t1Wf样品，J&J在株小fti或的Jlil.1j分不段(斗iiII-r).;反j:ti双蒸水冲洗，去

7、掉到n!ti养基。注样品加Ijf叶过拈/lii.j监免交叉感染.，1成一次tURlIi什浓nilll J.I,lH K A根知测试样本数irlJ直比例1111入各试剂.iM匀.1古川4述RJA平11随机引物(191M i!ri-(千1111人151.。将含混合均匀的I勾心岱;J!l.1:(于tITilt hM(-I;l7.C似iMLO lllin.420Cjl 50 mn.720C似ill10 min。反转kf成的cJ)NA立UIJill豆时荧光PCR反!也成-20.C泊、存.存放lI.t问不宜超过6个川。7.4 实时荧光PC扩增将jII.1必)(;PCR反应所titi试剂i立冰削IM业化。l

8、yl个训li样本反凶1!ir:自配制参见附KA，flH，;洲战中(川敛+，ljj(比例1111入各试开iJ，i昆匀，向TJ:个:;再11.1火光PCRWIIJlI入2;1.0 11.，.Ii!JlI人反tO;g产物1.0/1.，il-t匀。将实I I.)(:)(;PCR反应位放入茨光PCR检测仪内。设i吨反应在IU于;Joj，95.C3 min;95.C 15怡52.C 15 s,72.C 20日40个循环。设Y:PCI仪.ft:1吐个彻肉、(1(172.C延I阶段tl!dl二尖)(;古LJ。反应约束1口，绘制|产物的好!(WIIIII线。7.5 实验对照1111iI:M!，已知感染俯萄扇叶病

9、毒的样品RN八反转沃的cDN八.IJn对!(!，已知l未感染俯萄扇叶病毒的样Ilfi，RN反转沃的c()NA。价JIM!(!，以灭的可双茶水代桥cDJA.8 结果判定和描述8 1 有效判定原则对!(!JiiJII，t满足下列忻况的，WJ认为纺织有效，有!tJ认为元放，应fiJfr进行检测。节IIM!(山Jct(j.D.x CI 0应35.0.1lA35.0.1l未H且t)IU凹的扩WIII1I线门烁IfW(.11I1绒的ffi可他性li度的值与问lI:川!(1不敛。I 111刘!任。由U.，U.8.2 检测结果判定打扮出IJ，li朱元。值.或ctili35.O.f!兀典型(I1t.1,:111

10、1线，1，1熔I卿押11州11川11线的H向j肮曲仰;1(，阶t链乱#站讯jlU皮且由峰哗#伯it J州问阳II刊件iX川1升刘.1!照!(引f自 刁不、1敛虫.)农二U1I川可叫十怦(:111川lJ;检i测伊圳川J眩f纣4J占t飞1;朱i托Ct伯也运三3犯0.0山现典型的扣扩.附11州11川11主线j足0:;，门t如炜7非￥f仰仰11山11川1 1线的l仰H链乱ilit度与|月咐，M!H3主.-l/1、样*,1 1I1i萄，1111才州市。ll:命由!IJ鸟飞*ct(j(为30.035.O.币-Ji:ifrill1 1炎光PCI检测，Ilj次检测结果。r仍小r:15.0嘈:1:1:咒典型的扣

11、.WII 11 1线.门熔自111111线fU开链irH主岭(与111InxJ!(!敛，!tJJtJl样斗:1:1:1含有葡萄刷叶病毒;有!tJrtJ定样川i叫、;-1J俯在2后才11十病毒。8.3 结果描述i主样tlh检:1俯1，;扇叶病毒。l在中1:，11114小生:H他销扇叶州碍。3 NY/T 3785-2020 附录A(规范性附录)葡萄扇叶病毒反转录反应及实时荧光PCR反应混合液配制A.1 单个测试样本反转录反应混合液配制方法!Ai.，1号A.10 表A.l4 NY/T 3785-2020 附录B(资料性附录)典型的实时荧光PCI扩增曲线及熔解曲线解链温度8.1 典型的实时荧光PCR扩

12、增曲线见II13.1。阳性别照帽试样品自1世x.j照IIX.J照15阳1mm 国摆棋坦言茸。三77二10 W m 循环盘图B.l典型的实时荧光PCR扩增曲线8.2 典型的实时荧光PCR溶解曲线解链温度见F￥11主2040 酣试样AJt已，时HI性;H!f!叫11/z呈 200 t.1.1.j.l J71三三1￥65 70 75 80 90 95 圳匪!于图11.2 熔解曲线解链温度p d ONON-U后回汩Z1 1叶农才:1:扳平1:1 版ItJit II中jJl旧Ix:d子川，街18去怯IJ.I1I:)ji:印刷I W1I 新华-1日i.11:;(发行19i发l i轩j也新华11日;约销-,提4峰111政当地向100125 夺印张D.75j-数15千千2021年3)1 JtJ立刻1I大印刷定价21.00 7巳版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 2021年3)/到11:&II-,16109.8126,-,11丰880mmX1230，m 1/16