SC∕T 7241-2020 鲍脓疱病诊断规程(水产).pdf

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1、ICS 65.020.30 B 41:才:中华人民共和国水产行业标准SC/T 7241一2020鲍腺癌病诊断规程Code of diagnosis for abalone pustule disease 2020-08-26发布2021-01-01实施中华人民共和国农业农村部发布SC/T 7241-2020 I SC/T 7241-2020 鲍腺癌病诊断规程范围本标准给出了鲍版痕病(abalonepustule disease)的术语和l定义、缩略语、试剂和材料、器材和设备、l临床症状与表现，规定了采样、组织病理检测、PCR检测l及综合判定。本标准适用工蛐盹瞄睛曲宿仨醋晶2 下列忏凡是不注日期

2、的引3 4 5 SC/T 7011 SC/T 7205.下列bp DAFA DNA,dNTPs EDTA,PCR,Tq酶TE,Tris Tris三委主试剂和材料5 1 除非另有说明，标准5 2 无水乙醇.5.3 TE缓冲液见附录A中的人10 5.4 抽提缓冲液见A.205.5 蛋白酶K见A.30 5.6 10 mol/L乙酸镀见A.40 5 7 平衡盼。5.8 盼/氯仿/异戊薛(25 24 1)。5 9 氯仿/异戊醇(24:1)。5.10 1 X电泳缓冲液见A.505.11 70%乙蹲见A.6。5.12 diITPs(各2.5 mmol/L):生化试剂，含dP、dTTP、dGTP、d口?各2.

3、5mmol/L的混合物，-200C SC/T 7241-2020 保存，用于PCRo5.13 10XPCR缓冲液生化试剂，无Mg2+，随TaqDNA聚合酶提供，一200C保存。5.14 MgCl,(25 mmol/U生化试剂，-200C保存。5.15 T，叫DNA聚合酶(5U/J.lU田生化试剂，一200C保存。5.16 正向引物VFtoxR-F(10mol/U，5-GACCAGGGCTTTGAGGTGGACGAC-3，-200C保存。5.17 反向引物VFtoxR-R(10mol/U,5-AGGATACGGCACT1GAGTAAGACTC-3,-200C保存。5.18 PCR检测阳性对照为已

4、知感染河流弧菌且PCR结果显示阳性的鲍组织样品，一700C保存。5.19 PCR检测阴性对照为己知未感染河流弧菌且PCR结果显示阴性的鲍组织样品，一700C保存。5 20 PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。5.21 琼脂糖。5.22 DNA分子量标准。5.23 筛绢(600目)过滤海水。5.24 DAFA固定液见A.7。5.25 苏木精染色液见A.805.26 1%伊红储存液见A.9。5.27 1%焰红储存液见A.lOo5.28伊红焰红染色液见A.llo5.29 95%乙E事。5.30 85%乙醇见A.1205 31 80%乙醇见A.1305.32 75%乙醇见A.14。5.33 50%乙

5、醇见A.1505.34 二甲苯。5.35石蜡(熔点520C540C)。5.36 中性树胶。6 器材和设备6 1 石蜡切片机。6 2 组织脱水机。6 3 包埋机。6.4 染色机。6.5 展片水浴锅。6.6 恒温箱。6.7平板烘片机。6.8 显微镜。6.9 PCR仪。6.10 电泳仪。6.11 水平电泳糟。6.12 紫外观察仪或凝胶成像仪。6.13 高速离心机。6.14 微量移液器。2 SC/T 7241-2020 7 临床症状与表现病鲍食欲降低，腹足上有单个或多个隆起的白色胶痕，温度到高时病情加重，版范破裂后流出大量自色版汁并留下2mm.-.5 mm的创面。随着病程延长，足面肌肉出现不同程度的w

6、t烂，鲍附着力下降或完全不能附着、甚至死亡。参见附录BoB 采样8.1 采样对象皱纹盘鲍(Hal iotisdiscus)等易感品种，参见附录B。选择濒死或表现出第7在中所描述临床症状的个体。8 2 采样数量、方法和保存运输应符合SC/T7205.1-2007附录B的要求.8.3 样品采集样本采集前使用灭菌水冲洗腹足部位，取2mm5 mm厚鲍腹足组织，立即保存于DAFA固定液中，固定12h24 h后，进行组织病理检测或转移到70%乙醇中暂存;取30mg50 mg腹足组织，立即进行DNA提取或暂时保存于200C冰箱。9 组织病理检测9.1 脱水将组织块置于脱水机中或依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的

7、容然中，流程如下:75%乙醇(lh45 min)85%乙醇(1h 45 min)85%乙醇(1h 45 min)95%乙醇(45min)95%乙碎(45min)无水乙醇(45min)无水乙醇(45min)0 9.2 透明脱水后的组织块置于脱水机中或依次浸入盛有无水乙酶:二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的容器中，流程如下.元水乙醇:二甲苯(1:1)(25 min)二甲苯(20min)二甲苯(20min)。9.3 浸蜡恒温箱温度调节至高于石蜡熔点30C。流程如下:透明后的组织块依次浸入2个盛有融化石蜡的容器中各80min。9.4 包埋将包埋机或恒温箱温度调节至高于石蜡熔J点30C进行熔蜡，将熔蜡

8、倒入包也盒，也可用折叠纸盒;用预温的饭子迅速夹取组织块，切面朝下平放在模具底部，轻轻提起模具，置于冰上使其冷却l凝固。9 5 切片用蜡铲或刀片将包埋块四周修平，使上下两面平行，保留组织周围附着宽2mm3 mm的石蜡。用石蜡切片机切片，厚度5m。对每个石蜡包埋块至少切取2张不连续的切片。9.6 展片将切片平放于展片水浴锅水面上，待伸展平整后，用载玻片捞出，置于烘片机上或烘箱内，450Cj烘片2 ho 9 7 染色将切片放在玻片架上，置于染色机中或依次浸入盛有不同溶液的容器中，流程如下:二甲苯(5min)二甲苯(5min)无水乙醇(2min)元水乙醇(2min)95%乙醇(2min)95%乙酿(2

9、min)80%乙醇(2min)80%乙醇(2min)50%乙蹲(2min)蒸馆水(2min)蒸馆水(2min)蒸馆水(2min)迈尔-班尼特苏术精染色液(5min)缓慢流动的自来*(6min)伊红焰红染色液(2min)95%乙酶(1 min 20 s)95%乙醇(2min)无水乙酶(2min)元水乙醇(2min)二甲苯(2min 30 s)二甲苯(2 min 30 s)二甲苯(2min 30 s)。3 SC/T 7241-2020 9.8封片滴加2滴中性树胶封片。9.9 观察在光镜下观察，病饱的腹足肌肉和结缔组织变性、坏死。受感染结缔组织细胞坏死、溶解，并出现大:!l血细胞浸润，部分血淋巴细胞

10、质膜破裂，参见附录C。9 10 结果判定病鲍腹足肌肉和结缔组织若出现9.9所述特征病灶，判断为鲍版痕病疑似阳性。10 PCR检测10.1 DNA的提取10.1.1取30mg-50 置阳性对照、阴性对照10 1.2 10.1.3 两相.10.1.4 10.1.5 10.1.6 水乙蹲(10.1.7 10.1.8 10.1.9 一20C冰箱。注，25L体系棋极lltlL.温浴1h。提取过程同时设水浴3h，不时旋动。2 mL PCR管中.分、阴性对照和空白对照。10.2.2 PCR扩增反应程序:将上述加有DNA模板的PCR管置于PCR仪中，按以下程序进行扩增-94C预变性5min;94C变性305、

11、65C退火305、72C延伸305，35个循环;72C延伸7min，4C保温。10.3 琼脂糖凝胶电泳及测序10.3.1 配和tll.5%的琼脂糖凝胶，加入核酸染料，摇匀，制备琼脂糖凝胶.SC/T 7241-2020 10.3.2 将5LPCR反应产物与lL6X载样，缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时设立DNA分子量标准对照。10.3.3 使用1V/cm5 V/cm电压，在电泳缓冲液中电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中澳盼蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/22/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。10.3.4 如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测

12、序。10.4 结果判定阳性对照在217bp处有特定条带、阴性对照在217bp处无条带且空白对照不出现任何条带，实验结果有效。检测样品在217bp处有条带，测序结果同参考序列(参见附录D)进行比较，序列符合的可判断为河流弧菌PCR结果阳性，检测样品在217bp处无条带可判为PCR结果阴性。11 综合判定11 1 疑似病例的判定符合以下一条及以上，可判定为疑似病例:a)病鲍出现典型的1 1面床症状与表现，且组织病理检测结果为阳性;b)PCR检测结果阳性。112 确诊病例的判定病鲍组织病理检测结果为阳性，且PCR检测结果阳性、测序结果符合，判定为确诊病例。5 SC/T 7241-2020 A.1 1

13、卫缓冲液(pH8.0)1 mol/L Tris HCl(pH 8.0)0.5 mol/L EOTA(pH 8.0)加水定容至高压蒸气灭菌，4C储存。A.2 抽提缓冲液1 mol/L Tris HCl(pH 8.0)0.5 mol/L EOTA(pH 8.0)1 mg/mL H在RNA酶10%SOS 加水定容至?昆匀，室温储存。A.3 20 mg/mL蛋白酶K附录A(规范性附录)试lfiJ配方10 mL 2 mL 1000 mL 1 mL 20 mL 2 mL 5 mL 100 mL 蛋白酶K20 水1mL 溶解后分装于无菌离心管中(0.25mL/管)，-20C下保存。A.4 10 moI/L

14、Z:酸锻乙酸镀水加水定容至100mL，经0.45m滤膜过滤除菌，4C储存。A.5 1 x电泳缓冲液Tris 冰乙酸。.5mol/L EOTA(pH 8.0)加水定容至室温储存。A.6 70%乙醇无水乙醇加水30mL，混匀，定容至分装后，室温储存。A.7 DAFA固定液95%乙醇6 77 g 30 mL 4.8 g 1.1 mL 20 mL 1 000 mL 70 mL 100 mL 330 mL 甲1ft(37%)冰醋酸过滤海水混匀，室温密封储存。A.8 迈尔-班尼特苏木精染色液温水(500C_600C)苏木素破酸告内例明矶拧橡酸水合三氯乙1ft按上述顺序混合1%焰95%乙醇冰醋酸A 12 8

15、5%Z醇95%乙醇加水定容至混匀，室温储存。A 13 80%乙醇95%乙醇加水定容至?昆匀，室温储存。A 14 75%乙醇95%乙醇加水定容至?昆匀，室温储存。220 mL 115 mL 335 mL 1000 mL 1 g 800 mL 950 mL 750 mL 950 mL SC/T 7241-2020 7 SC/T 7241-2020 A.15 50%Z醇95%乙醇加水定容至混匀，室温储存.8 500 mL 950 mL SC/T 7241-2020 附录B(资料性附录)鲍腺癌病及其病原简介鲍腺癌病是由河流弧菌(Vibriouvialis)感染鲍(Haliolis spp.)引起的传染

16、病，主要流行于我国北方沿海养殖地区，为我国水生动物三类疫病.河流弧菌，隶属于细菌域(Bacteria)变形菌门(Proteobacteria)变形菌纲(Gammaproteobacteria)弧菌目(Vibrionales).属于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌属(Vibrio)成员。河流弧菌可以感染多种鱼类、甲壳类和贝类等水生动物。鲍版癌病常发生于幼鲍和稚鲍，夏季易发病，特别是连续高温时，发病频繁且持续时间长，死亡率可达50%-60%.给鲍养殖产业造成极为严重的经济损失。鲍B在痞病的感染途径主要为创伤伤口，口服无感染力。版范病病原菌从鲍腹足伤口进入体内，通过血淋巴进入全身各组织器官，经

17、过l个月-3个月的潜伏期，最后在腹足上出现病灶。榄坝IJ鲍腹足受伤是感染Jt(t范病的直接原因，尤其当鲍体质下降时，更容易感染发病.养殖管理不善，如换水不彻底、不及时，使养殖环统比较恶劣，也成为诱发鲍腺癌病的主要原因。若不及时采取有效的疫病防控措施，极易造成交叉感染和疫病快速传播。患腺癌病病鲍腹足可见一个至数个微微隆起的白色版疵，病灶是从腹足的下表面开始逐渐扩大、深入到腹足内部。发病初期病灶较小，随着病程的进展，病灶逐渐扩大。腺癌一般可维持一段时间不破裂，又季持续高温时，病情加重，病程缩短，腺癌在较短时间内即行破裂，破裂隙殖流出大盐白色服汁并留下2mm.5mm的深孔，镜检版汁可见有运动能力的杆

18、形细菌。在痛破裂后的创口使足而肌肉出现大小不同的溃烂。此时病鲍附若能力差或完全不能附着，从附着波纹板上脱落、甚至死亡。9 SC/T 7241-2020 附录C资料性附录)鲍腺癌病临床症状和组织病变示例C.l 病鲍腹足出现腺癌和古董烂。图C.l给出了患版殖病病饱腹足观察图。国C.l患腺癌病皱纹盘鲍腹足膝痛(黑箭头)和溃烂(自箭头)C.2 病鲍腹足肌纤维排列混乱疏松，并溶解消失。图C.2给出了鲍版痕病组织病变观察图。图C.2怠腺癌病皱纹盘鲍腹足肌肉组织病变10 SC/T 7241-2020 附录D(资料性附录)河流弧菌PCR产物序列1 GA卫GGGCfTfGAGG于GGACGA!C1U二AGCCT

19、GACTCAAG CC且CTCAAC士认立AA61 ATGCTGAAAG ACTCGA:AAGTCG士rcAGTTTGTGAAAA:;GT汇AAAACGGGT丁lJ121 CAG巴尼CG;ACCGCGAAAGCGTCAGCTCGATGCAA GlAAGATO二G姐飞二姐181 GAGCAGTCAG A TGAGTCTTA CTCAAGTGCC GTATCCT 注:下划线为引物VFtoR-F和IVFtoR-R。11 ONON-石NhH川书华中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址www.CC呻)化学工业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*峰4峰开本880mmX1230mm 1/16 印张1字数20千字2020年12月第1版2020年12月北京第1次印刷书号16109 8364 定价25.00元奇峰4时版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 SC/T 7241