NY∕T 3282.1-2018 真菌微生物农药 金龟子绿僵菌 第1部分：金龟子绿僵菌母药(农业).pdf

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1、ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3282.1-2018 真菌微生物农药金龟子绿僵菌第1部分:金龟子绿僵菌母药Fungal pesticides-Metarhizium anisopliae一Part 1:Metarhizium anisopliae technical concentrate(TK)2018-07-27发布2018-12-01实施;筒中华人民共和国农业农村部发布NYjT 3282.1-2018 目U昌NYj T 3282(真菌微生物农药金龟子绿僵菌分为3个部分:一一第l部分:金龟子绿僵菌母药;一一第2部分:金龟子绿僵菌油悬浮剂;第3部分

2、:金龟子绿僵菌可湿性粉剂。本部分为NY/T3282的第1部分。本部分按照GBjT 1.1-2009给出的规则起草。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业农村部农药检定所、重庆大学、重庆重大生物技术发展有限公司。本部分主要起草人:王中康、王晓军、殷幼平、杨峻、李向英、郭明程、胡丽。I 1 范围真菌微生物农药金龟子绿僵菌第1部分:金龟子绿僵菌母药NY/T 3282.1-2018 本部分规定了金龟子绿僵菌母药的术语和定义、要求、试验方法、产品的检验和验收，以及标志、标签、包装、储运、安全和保质期。本部分适用于以分生抱子为主要成分的粉状金龟子绿僵菌母药。2 规范性引用文件下列文

3、件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 191 包装储运图示标志GB/T 1601 农药pH值的测定方法GB/T 1604 商品农药验收规则GB/T 1605 商品农药采样方法GB 3796 农药包装通则GB/T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 16150 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 金龟子绿僵菌母药Metarhizium anisopliae technical concentrate(T

4、K)金龟子绿僵菌纯菌种经生物发酵获得的高含量的单一或组合形态的活菌体母药，通常情况还会包含伴随发酵过程的相关生物组分。3.2 分生抱子conidia 真菌的一种无性繁殖细胞，由分生抱子梗上产抱细胞产生，是真菌农药中最常见的形态，简称抱子。3.3 含抱量spore content 每单位金龟子绿僵菌母药样品中所含金龟子绿僵菌抱子的数量。3.4 活于包率percentage of Iiving spores 即抱子萌芽率，指在一定培养条件下，萌芽的金龟子绿僵菌抱子数占总抱子数的百分率。3.5 菌落形成单位colony forming units(CFU)以涂布方法，使单个分生抱子分散生长在营养琼脂

5、培养基上，每一活抱子形成一个菌落，即为菌落形成单位(CFU)。1 NY/T 3282.1-2018 3.6 杂菌率rate of microbial contaminants 金龟子绿僵菌母药样品中除绿僵菌抱子外，其他菌(真菌和细菌等)量占总菌量的百分率。3.7 储存稳定性storage stability 金龟子绿僵菌母药在室温或低于室温下密闭储存一定时间后，产品的活抱数占其标明值的相对百分率。4 要求4.1 外观外观通常为浅绿色至暗绿色粉末，由于发酵基质的不同颜色偶有差异;应为均匀疏松的粉末，不应有结块。4.2 规范项目及指标金龟子绿僵菌母药质量控制项目应符合表1的要求。表1金龟子绿僵菌母

6、药控制项目指标项目指标含抱量，亿袍子/g二三250活于包率，%二三85杂菌率，%5 干燥减盘，%主二8细度(通过175m试验筛)，%二三90pH 5.5-7.0 储存稳定性a，%二三80定期检测项目:每6个月检测一次。5 试验方法5.1 一般规定除非另有说明，试验方法所用试剂级别为化学纯及以上，所用、溶液均为水溶液。5.2 抽样按照GB/T 1605的规定进行样品的采集，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不少于200 g。抽样时，从不同部位随机抽取至少3个样点的抱子粉，混合均匀。采样时，应特别注意样品的代表性和避免污染，采集容器和采样工具应经过消毒灭菌。样品采集后，应立即检验，若不能立即

7、检验，可储存在40C冰箱中。5.3 菌种鉴别形态学特征观察:以划线或稀释涂布法将样品在萨氏培养基1/4SDAY上纯化培养，观察菌落形态颜色或色素等特征。用显微镜观察菌丝体、产抱梗和分生抱子并测量大小，对比近源绿僵菌的形态学特征描述进行鉴定。有效成分的特征描述参见附录A。菌种鉴别采用形态学特征观察和分子鉴定相结合的方式进行。常规检测主要根据代表菌株的形态学特征进行菌种鉴别。分子鉴定可采用核糖体rRNA基因序列或其他目标基因序列分析。菌种鉴别原则与方法见附录B。5.4 含抱量测定5.4.1 方法提要显微镜血球计数板计数法。将抱子样品加人吐温80榕液中，用高速匀浆器搅拌制成抱子悬浮液，2 NY/T

8、3282.1-2018 并稀释至适当倍数K后，在光学显微镜下用血球计数板直接计数抱子数，然后计算单位质量试样中的真菌含抱量。5.4.2 试剂和溶液吐温80。0.1%吐温80榕液:(吐温80:水)=1:10000 5.4.3 仪器及设备电子天平:精度为0.001g。光学显微镜:目镜物镜=4OO倍。高速匀浆器:转速二注三孔10OOr旷/m丑lln超净工作台。恒温培养箱。亮线血球计数板:25X 16规格。微量移液器:0.2 mL1.0 mL。手动计数器:19999o容量瓶:100mL。三角瓶:250mL。5.4.4 试验步骤5.4.4.1 将试样混均匀后，称取约1.0 g(精确至0.001g)试样2

9、份作为2个重复。5.4.4.2 将每份试样置于洁净三角瓶中，先用5mL吐温80溶液润捏，再加入吐温80溶液60mL制成抱子悬浮液并在高速匀浆器上搅拌5minO 000 r/min)，转移至100mL容量瓶中定容、摇匀，配制成A悬浮液(稀释100倍)。5.4.4.3 用移液器准确吸取1.0 mL A悬浮液至100mL容量瓶中，用吐温80榕液稀释至100mLC再稀释1001酌，并在高速匀浆器上混合均匀后备用。5.4.4.4 在血球计数板上盖好盖玻片后，用微量移液器吸取5.4.4.3的抱子悬浮液，在盖玻片边缘滴人，使液体沿边缘渗人盖玻片下，使其刚好充满盖玻片与计数板技术区域之间。应无气泡且计数区域四

10、周无液体，如有多余液体可用吸水纸吸去。5.4.4.5 用显微镜观察，待于包子静止后进行计数。在规划格区内，采取对角线5点取样的计数方法计数。上下区域各5个中方格06个小方格/中方格)，即双线范围内160小方格(计数时，对于中方格四周如有压线的抱子，计上双线不计下双线，计左双线不计右双线)的金龟子绿僵菌抱子数。5.4.4.6 每份试样点样计数次(=2)。5.4.5 测定结果试样的含抱量W按式0)计算。K X 400 X N5N1 ;.,.I.I.,Sl:一一0)160pm X O.1 X 10-3 X lO8 4m 式中:W1 一一试样的含抱量，单位为亿抱子每克(亿抱子/g);K一一稀释倍数00

11、000倍);N 一-p次计数的总抱子数(上下区域各5个中方格中计数的总抱子数);400一一血球计数板计数室小方格总数为25X16=400;160一一血球计数板上下区域各5个中方格的小方格的总数(5X 16 X 2=160);0.1一一血球计数板计数室体积，单位为立方厘米(mm3);lO-3一一立方毫米换算为立方厘米(mL)的倍数;3 NY/T 3282.1-2018 p 一一计数次数(2次);n2,一-试样质量，单位为克(g);108 一一代表108个抱子每克，即亿抱子每克。5.4.6 允许差2次平行测定结果相对差应不大于10%，取其算术平均值作为测定结果。5.5 活抱率测定5.5.1 玻璃纸

12、片萌芽抱子显微计数法5.5.1.1 方法提要将抱子悬浮液均匀涂在放有检。以抱子萌芽长度大于于包子率，即活抱率。5.5.1.2 试剂和溶液萨氏培养基0/离子水中。用精5.5.1.3 仪器电子天平光学旋涡振5.5.1.4.1 养皿中(每皿约(高温灭菌)。5.5.1.4.2?昆合均匀;b)再用接种环蘸取、恒温培养24h;c)用尖慑子分别取下3片后盖上盖玻片(尽量避免气在(25士l)OC下培养24h，制片镜子总数，计算抱子萌芽百分g溶人1000mL去为9cm的培的玻璃纸片下操作:，在涡旋振荡器中d)在光学显微镜下观察并计数萌芽的子包子数与未萌芽的抱子数，计算其抱子萌芽百分率。每次计数至少300个抱子。

13、3次测定结果的平均值作为1份试样的测定结果。5.5.1.5 测定结果试样的活抱率Wz按式(2)计算。Wz=是X100.(2)式中:Wz一一试样的活抱率，单位为百分率(%);4 Nj一一萌芽抱子数，单位为个;Nz一一检查抱子总数，单位为个。5.5.1.6 允许差NY/T 3282.1-2018 2次平行测定结果之差应不大于10%，取算术平均值作为测定结果。通过肉眼观察菌落的数量来推算单位微生物农药样品中的活抱子含量。5.5.2 稀释平板菌落计数法金龟子绿僵菌母药活抱率测定见附录C。5.6 杂菌率测定按照本部分5.4显微镜血球计数板计数法进行测定，检测样品中的金龟子绿僵菌和其他真菌和细菌的数量，杂

14、菌率W3按式(3)计算。W,=_ N2+N T.,0 X 100(3)Nj+Nz+N3 式中:W3一一杂菌率，单位为百分率c%);Nj一一试样中金龟子绿僵菌的总数，单位为个每克(个/g);Nz一一试样中非目标真菌的数量，单位为个每克(个/g);N3一一试样中细菌杂菌的数量，单位为个每克(个/g);5.7 干燥;咸量测定5.7.1 方法提要按加热诚量法测定，即试样经加热后，计算失去的水分占称取试样质量的百分率。5.7.2 仪器及设备电子天平:精度为0.001g。电热恒温干燥箱:控温误差+20C。称量皿:直径70mmX35 mm。5.7.3 试验步骤先将称量皿在005士2)OC电热恒温干燥箱内烘至

15、恒重称重(精确至0.001g)。称取试样约5.0g(精确至O.001 g)置于预先称重的称量皿内，放人005:r2)OC电热恒温干燥箱内干燥，1h后取出，在干燥器中冷却至室温，称重。5.7.4 测定结果干燥减量W4按式(4)计算。W4=生二旦1X 100(4)mz一-mj式中:W4一一干燥减量，单位为百分率(%);m j 一一称量皿的质量，单位为克(g);mz 烘前试样与称量皿的质量，单位为克(g);m一一烘后试样与称量皿的质量，单位为克(g)。5.7.5 允许误差2次平行测定结果之差应不大于0.5%，取算术平均值作为测定结果。5.8 细度测定按GB/T16150中干筛法的规定执行。5.9 p

16、H测定5 NY/T 3282.1-2018 按GB/T1601的规定执行。5.10 储存稳定性5.10.1 方法提要将试样密闭放置于50C低温储存12个月或150C250C常温储存6个月后，按照5.5.1的方法测定活抱率。储存后不低于活抱率初始值的80%。5.10.2 仪器及设备冰箱:50C。样品柜:室内控温范围150C250C。棕色磨口玻璃瓶:带有磨口瓶塞，确保样品密闭。5.10.3 试验步骤将20g试样放在玻璃瓶中，使其铺成平滑均匀层。密封后，置于50C冰箱中放置12个月或150C250C下放置6个月后，按照5.5.1的方法测定活抱率。6 产品的检验和验收应符合GBjT1604的规定。极限

17、数值处理应按照GBjT8170-2008中4.3.3的要求进行。7 标志、标签、包装、储运、安全和保质期7.1 标志、标签应符合GB3796的规定，同时注明储运条件。7.2 包装应符合GB3796和GBjT191的规定。7.3 储运储运时，应严防日晒及350C以上高温，置于阴凉干燥处。运输时，注意轻放，防止破损。不得与有毒有害物质混装、混运。7.4 安全在使用说明书或包装标签上应注明产品为微毒、防护措施等。7.5 保质期在本部分的储存条件下，质量保证期从生产日期算起，12个月内产品活抱率不低于标示值。6 NY/T 3282.1-2018 A.1 中文通用名称金龟子绿僵菌。A.2 拉丁文学名Me

18、tarhizium anisoLiae A.3 生物学分类地位附录A(资料性附录)金龟子绿僵菌有效成分描述菌物界、子囊菌门Ascomycota、盘菌亚门Pezizomycotina、粪壳菌纲Sordariomycetes、肉座菌亚纲Hypocreomycetid挝、肉座菌目Hypocreales、麦角菌科Clavicipitace町、绿僵菌属Metarhizium、金龟子绿僵菌MetarhiziumanisoLiae。A.4 生物学特性A.4.1 菌落特征在1/4SDAY培养基上菌落初期白色，背面可见淡黄色色素，后期产抱后呈暗绿色，分生抱子聚集成堆。菌株可以在SDAY上280C生长1周，直径可

19、达3.5cm。A.4.2 形态特征菌丝具分枝分隔，粗1.4m2.1m。瓶梗型产抱细胞，大小幅度为(2.12.9)mX(7.1 7.5)m;从瓶梗顶端产生分生抱子链;抱子链连接点倾斜度小;分生抱子单细胞，长椭圆形至近柱状，两端钝圆形。分生于包子有时单生于菌丝分枝末端;分生于包子长度大于15m。A.4.3 核糖体基因分子鉴定结果通过菌株总DNA扩增、克隆转化，测定绿僵菌菌株的ITSl-5.8S rDNA一ITS2的特征序列(见图A.l)。金龟子绿僵菌菌株的ITS1-5.8S rDNA-ITS2目的基因序列全长为552bp，其中5端包含部分18S rRNA基因序列:149为部分18SrRNA基因序列

20、。3端包含部分28SrRNA基因序列:520552为部分28SrRNA基因序列。其余的则为ITS区:50195为ITS1区域全序列，196342为5.8SrRNA基因全序列，343519为ITS2区域的全序列。综合培养性状及形态特征以及ITS1-5.8-ITS2 rDNA分子克隆测序比对结果，鉴定该菌株为金龟子绿僵菌(MetarhiziumanisoLiae)。TTTTUGCTTTAAJTCAGCGGGTAGTCCTACCTGUTCGAGGTCAACTUGTTGGGGGTTTT TACGGCAGTGGACCGCGCCGGGCTCCTGTTGCGAGTGTTTTACTACTGCGCAGAGGAG

21、GGCCACG GCGAGACCGCCAATCAAJTTAAGGGACGGCTGTGCTGGAAAACCAGCCTCGCCGUCCCCAACAC CAAGTCCACAGGGGACTTGAGGGGCGTAUGACGCTCGAACAGGCUGCCCGCCAGAAJACTGAC GGGCGCAAJGTGCGTTCAAAGUTCGUGUTCACTGAAJTCTGCAAJTCACUTACTTUCGCUT TCGCTGCGTTCTTCUCGUGCCAGAACCAAGAGUCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCUTTTTTTT 7 NY/T 3282.1一2018T AACCACTCAG AAG AT

22、 ACTT ATT AAAAu叮TCAGAAGGTTTGGGTCCCCGGCGGGCGCGAAGTCCCGCCGAAGCAACAATGAAAGGTATAATTCACAGGGGTTGGGAGTTGGATAACTCGGTAATGATCcc TCCGCAGGTTCACTAAACGGAAACA 图A.l金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)核糖体基因扩增序列A.5 有效成分主要存在形态分生抱子。A.6 生物活性杀虫。A.7 适宜生长条件最适培养基为萨氏培养基(1/4SDAY);最适生长温度为280C。分生于包子及菌落形态见图A.2。图A.2金龟子绿僵菌分生于包子及菌落形态8 NY/

23、T 3282.1-2018 附录B(规范性附录)金龟子绿僵菌菌种鉴别方法B.1 主要仪器设备和材料除常规微生物试验操作所需要的设备和培养条件外，其他还包括:PCR扩增仪、水平电泳仪、超净工作台、高速冷冻离心机、琼脂糖凝胶电泳仪、电子天平(感量0.0001 g)、高压灭菌锅、恒温培养箱、菌落计数仪(可选)、培养llIl.(9cm)、生物显微镜00 X100倍)等。B.2 主要培养基和试剂试剂:煎糖、蛋白陈、酵母浸提物、琼脂粉等。10XPCR反应缓冲液、500mmol/L KCI、100mmol/L Tris CI和1.0%Triton X-100;25 mmol/L MgC12;4种dNTP混合

24、物:每种2.5mmol/L;Taq DNA 聚合酶5U/L;l%琼脂糖;5XTBE电泳缓冲液。培养基:1/4SDAY:煎糖10g/L、酵母浸提物5g/L、蛋白陈2.5g/L、琼脂20g/LCpH 6.5)。B.3 形态学特征鉴别B.3.1 菌落形态观察在1/4SDAY培养基或PDA培养基上生长，260C280C培养7d，观察菌落培养性态特征，并测量菌落直径。在1/4SDAY培养基上菌落初期白色，背面可见淡黄色色素，后期产抱后呈暗绿色，产抱时灰绿色至暗绿色，自菌落中心由里向外长出成丛的绿色分生抱子堆。分生于包子梗单生或聚集或紧密排列，帚状分枝或轮生体。后期培养物菌落呈壳状。B.3.2 菌体观察用

25、生物显微镜观察菌体形态、产抱梗和分生抱子形态等。菌体显微形态观察方法如下:先将绿僵菌接种到1/4SDAY固体培养基上，在菌落边缘嵌入5mmX5 mm的灭菌盖玻片，260C280C培养1周。取下盖玻片制片后，显微镜检查，观察待测菌株的菌丝体、产抱梗和分生于包子的形态，并测定其大小。菌株形态特征:菌丝体分枝分隔;瓶梗型产抱细胞;分生抱子单细胞，长椭圆形至圆柱状，两端钝圆形，(4.35.2)mX 00.9 12.6)m。分生于包子有时亦单生于菌丝分枝抱梗末端。B.4 分子生物学特征鉴别选择虫生真菌核糖体目标基因，通过PCR体外扩增技术，采用SDS法提取绿僵菌基因组DNA，通用引物扩增绿僵菌的ITS目

26、标基因序列，目标基因经克隆测序后联机与数据库已知菌种进行同源性序列比对分析。鉴别到特定属种。B.4.1 PCR扩增B.4.1.1 DNA制备采用改良的SDS法提取绿僵菌基因组DNA。具体方法如下:a)取20mL 1/4SDY培养液于100mL三角瓶，打取一培养3d的绿僵菌菌饼(直径6mm)接到三角瓶于280C水平摇床，200r/min摇菌48h，取适量菌丝于1.5 mL离心管;b)加人提取液(10%SDS+氯化节)600L和适量石英砂于离心管，研磨至石英砂成粉末状后置于650C水浴60min,13000 r/min离心3min;9 NY/T 3282.1-2018 c)取上清液于1.5 mL离

27、心管并加入等体积的苯盼:氯仿:异戊醇(25:24:1)后，13000 r/min 离心3min;取上清液并加入氯仿:异戊醇(24:1)后13000r/min离心3min;d)取上清液加人等体积异丙醇沉淀DNA(-20oC放置1h),13000 r/min离心3min;70%乙醇洗涤2次，干燥，13000r/min离心3min。B.4.1.2 扩增引物与反应体系分别以绿僵菌基因组DNA为模板，选择通用引物扩增ITS-5.8S-ITS2区序列ITS-rDNA，宜采用:ITS-rDNA上游引物:5-GTTTCCGT AAGCTGAACCTGC一3;ITS-rDNA下游引物:5-ATATGCTTAAG

28、TTCAGCGGGT-3 0 绿僵菌序列特异性扩增PCR反应体系见表B.1。表8.1绿僵茵序列特异性扩增PCR反应体系PCR试剂原始浓度反应试剂终浓度，25L/管反应体系加样体积，L/管10X缓冲液1X缓冲液2.5 50 mmol MgC12 1.5 mmol/L O.75 10 mmol dNPTs 200mol/L 2.0 10 mol上游引物O.4mol/L 1.0 10 mol下游引物0.4mol/L 1.0 2.5 U/L Taq DNA聚合酶1U O.25 25 ng/LDNA模板25 ng 1.0 灭菌脱离子水补足25L/管16.5 ITS-rDNA PCR反应扩增程序如下:94

29、0C预变性1min，940C变性1min,550Cill.1 50 s,720C延伸1 min共30个循环，720C延伸10mino PCR扩增模板重复测试3次。B.4.1.3 扩增产物检测PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，以DNAMarker指示DNA条带的大小及相对位置，稳压125V电泳35min检测。凝胶成像系统观察，检测结果在图像处理系统中处理并保存。B.4.1.4 目的基因序列克隆与测序分析B.4.1.4.1 PCR产物连接T载体所需试剂来自宝生物公司TakaraT载体试剂盒(可根据实际需要适当调整)。连接T载体反应体系:Solution 1 5L;pMD19-T O.5L;

30、PCR产物4.5Lo B.4.1.4.2 转化大肠杆菌加10L连接产物于100L感受态细胞中，冰浴30min;420C热激90S;冰浴5min;110 500LLA 液体培养基，3rc150r/min摇床30min;100 mL LB固体培养基加1%青霉素0.1mL后倒平板，取50L菌液涂平板培养过夜(24h)。B.4.1.4.3 菌落PCR每板挑取转化后涂板的单克隆菌落5个，转接至装有500LLB液体培养基的1.5 mL离心管中，200 r/min 3rc摇床3h4 h;参照ITS扩增条件，取1L菌液作为DNA模板进行PCR反应;琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物;选择阳性菌落测序。B.4.1

31、.4.4 DNA序列分析测序结果经BioEdit等软件分析和手工校正后，联机登陆NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行BLAST序列比对，程序将测序基因序列分别与GenBank中已知菌种的ITS序列进行同源性比对。10 NY/T 3282.1-2018 附录C(规范性附录)稀释平板菌落计数法C.1 方法提要采用稀释平板菌落计数法，先将母药抱子用吐温80溶液润湿，制备10倍梯度稀释液;再涂布在1/4SDAY培养基上，28C培养48h，统计适度稀释培养基平板菌落总数CCFU)，以检测样品中Cg)的活菌数再除以绿僵菌单位质量的Cg)含抱量，计算样品金龟子绿僵

32、菌的活抱率C%)。C.2 试剂和溶液培养基:1/4SDAY、煎糖10g/L、酵母浸提物5g/L、蛋白陈2.5g/L、琼脂20g/LCpH 6.5)。C.3 仪器及设备恒温培养箱、培养皿(9cm)、生物显微镜ClOX 100倍)和菌落计数仪(可选)等。C.4 测定步骤将高压灭菌后的萨氏培养基1/4SDAY降压后取出，在无菌条件下倒入直径为9cm培养皿中(每皿10mL)，制成3mm厚的平板备用。将试样混合均匀后，称取2g试样2份，分别进行以下操作:将试样置于洁净三角瓶中，加入0.1%吐温80溶液98mL制成抱子悬浮液(约6X 1010个子包子/mL)，充分湿润后在高速匀浆器中混匀5min，标记为O

33、号。然后，参照表C.1C以稀释6次为例)进行梯度稀释。表C.1绿僵菌母药样品10信梯度稀释示例编号O 1 2 3 4 5 6 7 8 稀释液体积，mL100 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 加入上一稀释浓度溶液的体积，mL1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 累计稀释倍数10 2 10 10-10-5 10-6 10-7 10-8 10 10-10 每稀释度期望袍子数量，mL3X 109 3X 108 3X107 3X 106 3X105 3X10 3X103 3X103 3X10 在超净工作台中，将上述各梯度稀释液分别用微量移液器吸取

34、100L到培养基平板上，用曲玻棒涂布均匀。每一个稀释度做3次重复，在C25士1)C下培养2448h。选择适宜的稀释度，取菌落数在20个100个之间的平板进行计数。C.5 测定结果若只有1个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，则计算该稀释度3个重复平板金龟子绿僵菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数，作为每克金龟子绿僵菌母药中的活抱量。如第8号稀释度3个平板的菌落数CCFU)分别为28、26、30，则该母药的活抱数 Ws按式Cc.1)计算为:Ws=Cl4+13+15)/3X108 X I0=2.80 XlOlOCFU/g Cc.1)式中:Ws一一活抱数，单位为CFU/g.若有2个连续稀

35、释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，c.2试样中的活抱数Ws按式Cc.2)计算。NY/T 3282.1-2018 Ws二三:凡/0X1+0.1 X2)XO.1XK.(C.2)式中:叫一一试样中2个连续稀释度稀释的平板菌落数在适宜计数范围内的金龟子绿僵菌总菌落数，单位为CFU;l一一第1个适宜稀释度的调查平板数(3);向一一第2个适宜稀释度的调查平板数(3);K一二第1个适宜稀释度的稀释倍数;O.1一一一涂布平板使用的稀释液体积，单位为毫升(mL);示例:如果第一稀释度(10-8)的菌落数(CFU)为15、11、12，第二稀释度(10-7)的菌落数(CFU)分别为15、15、17，则活菌量为:W

36、s=05+11十四十15十15+17)/O X3+0.1X3)XO.1X10-8=2.57X101 0 CFU/g C.6 允许差2次平行测定结果相对差应不大于20%，取其算术平均值作为测定结果。12 FON-FNN的问问Z中华人民共和国农业行业标准真菌微生物农药金龟子绿僵菌第1部分:金龟子绿僵菌母药NY/T 3282.1-2018 提中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址vv.ccap.CO)中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*争e争夺开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张1.25 字数25千字2018年11月第1版2018年11月北京第1次印刷书号16109 4643 定价32.00元争等关版权专有侵权必究举报电话(010)59194261.1-2018