SN∕T 3681-2013 魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犃 犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪 狓犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻（犌 狅 狋 狅，）犠 犻 犾 犾 犲犿 狊，犲 狋犪 犾 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国湖

2、北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：甘琴华、厉艳、邵秀玲、封立平、刘彩霞、王英超、赵晖、李凤新、纪瑛。犛犖犜 魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了进出境植物及其产品中魔芋细菌性叶斑病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境魔芋细菌性叶斑病菌寄主植物及其繁殖材料中该病菌的检疫和鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 进出境植物苗木检疫规程魔芋细菌性叶斑病菌基本信息学名：犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犽 狅 狀

3、 犼 犪 犮 犻（，），犲 狋犪 犾 异名：犘狊 犲 狌犱 狅犿狅 狀 犪 狊犪 狏 犲 狀 犪 犲 犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻（，），犲 狋犪 犾，；犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犪 狏 犲 狀 犪 犲 犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻；犘狊 犲 狌犱 狅犿狅 狀 犪 狊狆 狊 犲 狌犱 狅 犪 犾 犮 犪 犾 犻 犵 犲 狀 犲 狊 犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻 分类地位：原核生物界（）、薄壁菌门（）、暗细菌纲（）、假单胞杆菌目（）、假单胞杆菌科（）、嗜酸菌属（犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓）。传播途径：带菌的种芋是远距离传播主要途径。在田间和温室，主要通过灌溉水、雨水、风力、修剪枝等传播

4、，由伤口、气孔和自然裂口侵入寄主组织。魔芋细菌性叶斑病菌的其他信息参见附录。方法原理根据症状现场采集病样，实验室开展分离培养纯化，及革兰氏染色、生理生化、致病性测定和分子生物学的检测，鉴定特征吻合，检测结果为阳性的，判定为魔芋细菌性叶斑病菌。仪器用具和主要试剂 仪器及用具生物显微镜、具透射光源的体视显微镜、超净工作台、电子天平、光照恒温培养箱、扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高压灭菌器、酒精灯、培养皿（直径：和）、医用注射器（）、针头（号）、医用手术剪、镊子、解剖刀、烧杯（）、试管（直径）、载玻片、盖玻片、量筒（）。主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。蒸馏水、蛋白胨、次氯酸钠或 乙醇、培养基

5、、犛犖犜 培养基、金氏（）培养基。培养基配制方法见附录。现场检测 抽样块茎或植株按 中的规定进行抽样。症状检查首先应查看植株是否萎蔫，检查植株的根茎叶等各个部位，叶片是否有斑点、下垂，根、茎或块茎是否腐烂。如果发现上述任何一种症状，切取或将整棵植株取回实验室检验。实验室检测 病原菌的分离培养 病原菌的分离用灭菌剪刀（或解剖刀）剪取可疑症状的植物组织，取表层组织切成约小块，先用 的乙醇浸泡 表面消毒，捞出后用无菌水洗次，最后把病组织置放在装有蛋白胨水溶液的无菌离心管中，用无菌的玻棒捣碎，用无菌接种环蘸取汁液在平板上划线，恒温培养后，检查是否有菌落产生。菌种纯化采用平板划线法，即用无菌的接种环蘸取

6、穹隆状、全缘、中央部淡紫桃色、周边透明的菌落后，在或平板上多次划线纯化，恒温培养，移出单个菌落后进一步扩大繁殖。革兰氏染色反应按 中的 进行实验。生理生化测定分离菌的生理生化测定，可结合实验室条件，选用以下任一方法进行。应用生化管或微量发酵管进行分离菌的生理生化测定。犃犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻标准菌株革兰氏反应阴性，氧化酶反应阳性，能分解丙二酸，不能利用 半乳糖、氨基乙醇。若上述特征符合则选取可疑菌落作进一步鉴定。应用 全自动微生物鉴定系统鉴定分离菌。按 规定的操作方法进行，如果 鉴定结果为犃犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻，则判定该分离菌 鉴定结果为阳性，选取可疑菌落作进一步鉴定。致病性测定将培

7、养 的分离菌用灭菌水配成浓度为 的菌悬液，用注射法接种到具片真叶的健康魔芋苗叶片上，分别设置阴性对照和空白对照。接种后植株在 保湿培养，后开始观察发病症状，每隔 观察一次。犃犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻标准菌株在接种 后接种部位开始出现小的水浸状病斑，后非接种部位出现病斑，随着时间的延长，病斑迅速扩展蔓延，周后病斑达到（）（）的大小。犛犖犜 分子生物学检测分子生物学检测见附录。通过电泳观察，若有 大小的产物带出现，且扩增产物与魔芋细菌性叶斑病菌（：）同源性达到 以上，则判定结果为阳性，否则判定结果为阴性。结果判定凡培养特征、生理生化特征与犃犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻吻合，且采用致病性测定或分子生

8、物学检测其中之一结果为阳性的，判定为检测样品中带有魔芋细菌性叶斑病菌；否则判定为检测样品中不带有魔芋细菌性叶斑病菌。样品保存 样品保存与处理保存样品经登记和经手人签字后置于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存个月。对检出魔芋细菌性叶斑病菌的样品应至少保存个月，以备复检、谈判和仲裁，该类样品保存期满后，需经灭菌后方可处理。菌株保存与处理从检测样品中分离到并鉴定为魔芋细菌性叶斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株转接到试管斜面上，恒温培养。然后置于冰箱中保存，定期（）转接，防止病菌死亡；或在菌悬液中加入 的甘油于 下保存；必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，下长期保存。结果记录与资料保存完整的实验记录包括：

9、样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。犛犖犜 附录犃（资料性附录）魔芋细菌性叶斑病菌其他信息犃 名称中文名称：魔芋细菌性叶斑病菌异名：类产碱假单胞菌魔芋亚种、燕麦假单胞菌魔芋亚种、燕麦食酸菌蘑芋亚种英文名称：；犃 症状特征在潮湿的自然条件下，魔芋叶柄伤口处被感染，感染处迅速扩大，叶斑出现。叶片产生斑点、下垂、腐烂，块茎腐烂，挤压病部有污白色菌脓溢出。人工接种，后接种部位开始出现小的水浸状病斑，后非接种部位出现病斑，随着时间的延长，病斑迅速扩展蔓延，一周后病斑达到（）（）大小。犃 寄主范围魔芋（犃犿狅 狉 狆犺 狅 狆犺 犪 犾 犾 狌 狊犽 狅

10、狀 犼 犪 犮）。犃 分布日本。犃 病原菌培养性状及形态特征在培养基上生长白色、圆形、透明、表面光滑、略微突起，培养后菌落直径。在培养基上产生棕褐色水溶物。该病菌菌体杆状，（），好氧型，极生单根鞭毛，无荧光，革兰氏反应阴性。（）占 。犃 近似种生理生化特征见表。表犃 近似种生理生化特征表菌种反应犃犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犮 犪 狋 狋 犾 犲 狔 犪 犲犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犮 犻 狋 狉 狌 犾 犾 犻氧化酶明胶液化犛犖犜 表犃（续）菌种反应犃犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犮 犪 狋 狋 犾 犲 狔 犪 犲犃犮 犻

11、 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犮 犻 狋 狉 狌 犾 犾 犻精氨酸双水解酶葡萄糖产酸丙二酸 半乳糖 氨基乙醇注：“”表示阳性反应；“”表示阴性反应。犛犖犜 附录犅（规范性附录）魔芋细菌性叶斑病菌常用的培养基配方犅 选择性培养基（犘犘犛犕）犅 成分磷酸二氢钾 酒石酸钠 硫酸胺 白氨酸 酚红 甲基紫氨苄青霉素钠 放线菌酮 双硫胺甲酰苯菌灵粉剂 琼脂粉 犅 配制方法将除氨苄青霉素钠、放线菌酮、双硫胺甲酰苯菌灵粉剂以外的成分充分溶解，加蒸馏水至 ，湿热灭菌 。使用前再添加已过滤除菌的三种溶液。犅 犢犘培养基酵母膏 蛋白胨 琼脂 加蒸馏水至 调整至，湿热灭菌 。犅 金氏犅培养基（犓犅）蛋白胨 甘油 犛犖犜

12、磷酸氢二钾 琼脂 加蒸馏水至 调整至，湿热灭菌 。犛犖犜 附录犆（规范性附录）分子生物学检测犆 病原细菌犇犖犃的提取犆 将供试菌株在斜面培养基上 培养。犆 将细菌悬浮液转移至一干净的 离心管中，犵离心 ，弃上清液，加入缓冲液、溶液 ，蛋白酶，混匀，水浴孵育。犆 加入等体积的三氯甲烷异戊醇（）混匀，犵离心 ，取上清液。犆 加入等体积三氯甲烷异戊醇（）混匀，犵离心 。犆 将上清液转移至一离心管，加入 倍体积的异丙醇，混匀，犵离心 ，弃上清液。犆 乙醇洗涤沉淀，室温干燥后，用 灭菌双蒸水溶解。注：也可用细菌提取试剂盒。病原菌提取也可省略，直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行反应。犆 引物序列采用如

13、下引物：，：。其中，。犆 犘犆犚反应体系及参数犆 犘犆犚反应体系反应体系见表。表犆 犘犆犚反应体系试剂名称终浓度 反应缓冲液 犜犪 狇 聚合酶 模板 补 至 犆 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照、阳性对照和空白对照的设置；阳性对照：采用魔芋细菌性叶斑病菌或含有待测基因序列犛犖犜 的质粒；空白对照：设两个，一是提取时设置的提取空白对照（以代替样品），二是反应的空白对照（以水代替模板）。犆 犘犆犚的反应参数 ；，个循环；最后 延伸 。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。犆 琼脂糖凝胶电泳制备的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和扩增产物，用 作为分子量标记，进行电泳分析，电

14、泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的条带，并拍摄记录。犆 犅犔犃犛犜同源性比较将扩增产物纯化后进行测序。测序结果在 中进行比对，比较产物与魔芋细菌性叶斑病菌的同源性。犆 结果判断通过电泳观察，若有 大小的产物带出现，且扩增产物与魔芋细菌性叶斑病菌（：）同源性达到 以上，则判定结果为阳性，否则判定结果为阴性。犛犖犜 参考文献回文广，赵廷昌，等哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立中国农业科学，：，犲 狋犪 犾 狆 狊 犲 狌犱 狅 犿狅 狀 犪 狊 犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犪 狊犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犪 狏 犲 狀 犪 犲 犪 狏 犲 狀 犪 犲 ，犮 狅

15、犿犫 ，犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犪 狏 犲 狀 犪 犲 犮 犻 狋 狉 狌 犾 犾 犻，犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犪 狏 犲 狀 犪 犲 犮 犪 狋 狋 犾 犲 狔犪 犲，犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犽 狅 狀 犼 犪 犮 犻 ，：，犲 狋犪 犾 ，：，犲 狋犪 犾 犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓 ，犅狌 狉 犽 犺 狅 犾 犱 犲 狉 犻 犪 ，犎犲 狉 犫 犪 狊 狆 犻 狉 犻 犾 犾 狌犿狉 狌 犫 狉 犻 狊 狌 犫 犪 犾 犫 犻 犮 犪 狀 狊 ，：犘狊 犲 狌犱 狅犿狅 狀 犪 狊狆 狊 犲 狌犱 狅 犪 犾 犮 犪 犾 犻 犵 犲 狀 犲 狊 犽

16、狅 狀 犼 犪 犮 犻 ，（犃犿狅 狉 狆犺 狅 狆犺 犪 犾 狌 狊犽 狅 狀 犼 犪 犮犓狅 犮 犺），：犘狊 犲 狌犱 狅犿狅 狀 犪 狊狆 狊 犲 狌犱 狅 犪 犾 犮 犪 犾 犻 犵 犲 狀 犲 狊 犓狅 狀 犼 犪 犮 犻，（犃犿狅 狉 狆犺 狅 狆犺 犪 犾 犾 狌 狊犽 狅 狀 犼 犪 犮），：，犲 狋犪 犾 犃犮 犻 犱 狅 狏 狅 狉 犪狓犪 狏 犲 狀 犪 犲犪 狊犃犃狏 犲 狀 犪 犲（），犃犮 犪 狋 狋 犾 犲 狔犪 犲（，），犃犮 犻 狋 狉 狌 犾 犾 犻 ，），犃狅 狉 狔 狕 犪 犲狊 狆 ，：犛犖犜 书 书 书 犜犖 犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元