SN∕T 3447-2012 草莓簇生植原体检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

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1、书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?草莓簇生植原体检疫鉴定方法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行?业?标?准草莓簇生植原体检疫鉴定方法?中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲?号?北京市西城区三里河北街?号?总编室?网址?中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本?印张?字数?千字?年?月第一版?年?月第一次印刷印数?书号?定价?元书书书前?言?本标准按照?给出的规则起草?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位?中华人民共和国烟台出入境检验检疫局?中国检验检疫科学研究院?本标准主要起草人?

2、粟智平?耿金培?张京宣?牟海青?鲁闽?栾晶?王颖?草莓簇生植原体检疫鉴定方法?范围本标准规定了草莓簇生植原体检疫鉴定的基本原则和分子生物学检测方法?本标准适用于草莓及草莓苗中草莓簇生植原体的检疫和鉴定?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件?仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?基因检验实验室技术要求?术语和定义下列术语和定义适用于本文件?聚合酶链式反应?在聚合酶的作用下?以?为模板?为底物?两条反向的引物对为起点?根据碱基配对原则?按照?的核苷酸顺序?合成与模板互补的?链的过程?是一种体外基因扩增技术

3、?实时荧光?试剂中含有一种荧光染料?这种荧光染料可以与双链?结合而产生荧光?利用荧光信号积累实时监测整个?进程?随着?反应的进行?反应产物不断累计?荧光信号强度也等比例增加?每经过一个循环?收集一个荧光强度信号?就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化?从而得到一条荧光扩增曲线图?在整个?反应完成后?会生成一条熔解曲线?峰值的高低可以确定?产物的量?单峰表示?扩增的强特异性?实时荧光?跟普通?引物一样?而不需要另外设计探针?方法原理?分类地位草莓簇生植原体?属于植原体?亚组?其他信息参见附录?检测原理本标准检测的主要依据是植原体的基因序列信息?首先?用根据植原体?基因的通用引物进行?扩增?以确定

4、检疫对象是否为植原体?然后?利用两对草莓簇生植原体的特异性引物?通过?实时荧光?及电泳检测进行结果判定?确定检疫对象是否为草莓簇生植原体?仪器设备?用具及试剂?主要仪器设备高速冷冻离心机?核酸蛋白分析仪?常规?仪?实时荧光?仪?电泳仪?凝胶成像分析系统?天平?感量?冷藏冷冻冰箱?旋涡振荡器?高温干燥箱?生物安全柜?水浴锅等?主要用具研钵和研棒?各种量程的可调移液器?各种吸头?离心管?等?主要试剂?提取试剂详见附录?试剂详见附录?实时荧光?试剂详见附录?检测与鉴定?引物设计根据草莓簇生植原体?基因的保守序列?采用了一对植原体通用引物?并设计了两对草莓簇生植原体特异性引物?和?具体序列及对应的基因

5、片段长度如下?对应的?产物长度为?对应的?产物长度为?对应的?产物长度为?的提取试剂及具体步骤详见附录?通用引物的?扩增及电泳试剂及操作详见附录?实时荧光?及电泳检测若?中通用引物扩增出?左右的?产物?则需要进行进一步的特异性?试验?试剂及具体操作详见附录?若?实时荧光?检测中结果呈阳性?则需将?产物进行进一步电泳观察?试剂及操作详见附录?防污染措施草莓簇生植原体检测过程的防污染措施应符合?的规定?制样用的研钵经过洗涤液清洗后?干热处理?结果判定?判断依据?引物的?产物长度为?引物?实时荧光?时有标准扩增曲线?且它们的?极为接近?熔解曲线峰值?熔解曲线峰值?引物的?产物长度为?引物的?产物长度

6、为?结果判定若检测结果同时满足?的三个条件?则判定为阳性?否则判定为阴性?样品保存与复核?样品保存与处理经鉴定?确定携带草莓簇生植原体的病株样品应在?冰箱保存?以备复核?该类样品保存期满后应经高压灭菌处理方可丢弃?结果记录与资料保存完整的实验记录包括?样品的来源?种类?时间?实验的时间?地点?方法和结果等?并要有经手人和实验人员的签字?实时荧光?结果需要有?扩增曲线图和熔解曲线图?凝胶电泳需要有电泳结果图?结果记录与资料保存期限至少?年?附?录?资料性附录?草莓簇生植原体其他相关信息?名称及简介中文名?草莓簇生植原体英文名?寄主范围目前只发现草莓?植物为其自然寄主?寄主在我国的种植和分布范围都

7、很大?容易定殖?分布地区该病原物主要分布于美国和加拿大?在我国尚未见发生?是我国新颁布的进境植物检疫性有害生物?传播方式主要通过带病的果苗和介体昆虫传播?易通过进口贸易运输传入?经济影响草莓是我国重要的水果作物?而该病由于病菌是由昆虫介体传播且速度相当快?因此一旦该病害传入具有较大的风险性?附?录?规范性附录?提取试剂与方法?主要试剂?抽提液?质量浓度?十六烷基三乙基溴化铵?于室温保存?可在几年内保持稳定?溶液?在?中溶解?缓慢加入?十六烷基三乙基溴化铵?同时加热并搅拌?如果需要?可加热至?溶解?定容终体积至?沉淀液?质量浓度?于室温保存?可在几年内保持稳定?缓冲液?或?或?巯基乙醇?异丙醇?

8、酒精?提取步骤?取所选新鲜材料的韧皮部及叶中脉?取适量液氮研磨成粉状后转移至?离心管?加入?抽提缓冲液?和?体积?巯基乙醇?再加入?蛋白酶?混匀?振荡?在?水浴?加入等体积?苯酚?三氯甲烷?异戊醇?离心?取上清液?加入等体积三氯甲烷?异戊醇?直至上清液和下层有机溶液分层清晰为止?取上清液?加入?体积?预热?及等体积三氯甲烷?异戊醇?离心?重复直至分层清晰?取上清液?加入等体积?沉淀液?颠倒混匀?加入?倍体积异丙醇?混匀后?离心?去上清液?保留沉淀?用?乙醇洗涤沉淀物?次?在超净工作台中晾干?灭菌双蒸水或?缓冲液重悬沉淀物?保存备用?附?录?规范性附录?凝胶电泳试剂与方法?试剂与方法?试剂见表?

9、表?试剂试剂名称加样量?缓冲液?含镁离子?上游引物?下游引物?酶?模板?补足反应总体积为?阴性对照?阳性对照和空白对照的设置阴性对照?健康的草莓叶片?阳性对照?草莓簇生植原体?阴性质控?灭菌双蒸水?反应参数?个循环?琼脂糖凝胶电泳试剂及方法?电泳试剂琼脂糖?加样缓冲液?溴化乙锭?相对分子质量标记物?电泳方法?制备凝胶将?和电泳级琼脂糖按?质量浓度?配好?在微波炉中熔化混匀?冷却至?左右?加溴化乙锭?加入溴化乙锭浓度为?混匀?倒入已封好的凝胶平台上?插上样品梳?待凝胶凝固后?从制胶平台上除去封带?拔出梳子?加入足够量的?缓冲液没过凝胶表面约?加样用适量?加样缓冲液分别与?样品混合?然后将其和适合的?相对分子质量标准物分别加入到点样孔中?电泳接通电源使?向阳极移动?当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离?片段时?关闭电源?结果观察将整个胶置于紫外透射仪上观察?附?录?规范性附录?实时荧光?试剂与方法?试剂和反应体系?实时试剂和反应体系如表?所示?表?试剂和反应体系试剂名称加样量?主要包括?聚合酶?荧光染料等?上游引物?下游引物?模板?补足反应总体积为?阴性对照?阳性对照和空白对照的设置阴性对照?健康的草莓叶片?阳性对照?草莓簇生植原体?阴性质控?灭菌双蒸水?实时?反应参数反应条件为?个循环?