SC∕T 7223.2-2017 黏孢子虫病诊断规程 第2部分：吴李碘泡虫(水产).pdf

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1、ICS 65.020.30 B 41 卡:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7223.2-2017 站于包子虫病诊断规程第2部分:吴李慎泡虫Protocols for diagnosis of myxosporidiosis-Part 2:Disease caused by Myxobolus wulii 2017-06-12发布2017-10-01实施;.中华人民共和国农业部发布SC/T 7223.2-2017 目。昌SC/T 7223(黠抱子虫病诊断规程拟分为如下部分:第1部分:洪湖腆泡虫;第2部分:吴李腆泡虫;一一第3部分:武汉单极虫;一第4部分:吉陶单极虫。本部分为SC/T722

2、3的第2部分。本部分按照GB/T1.1二2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部植业渔政管理局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会CSAC/TC156)归口。本部分起草单位:中国科学院水生生物研究所。本部分主要起草人:李文祥、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明。I 范围本部分给出了饵(Carassius李腆泡虫(Myxoboluswulii)病的综合判定。本部分适用于哪2 下列文件。凡是不注GB/T 6 SC/T 3 3.1水:3.2 乙醇:3.3 Taq 3.4 dNTPs 3.5 上游引下游引本对引3.6 DNA

3、mar 3.7 其他试剂见4 仪器和设备、唱4.1 解剖盘、剪刀、慑子、解4.2 体视显微镜和带测微标尺4.3 盖玻片、载玻片和培养皿。4.4 电子天平。黠子包子虫病诊断规程第2部分:吴李破泡虫4.5 普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6 普通冰箱。4.7 微量移液器。4.8 PCR扩增仪。4.9 离心管和PCR管。4.10 紫外透射仪或凝胶成像系统。SC/T 7223.2-2017 抱子虫病)的临床症状，规定了吴的方法，以及吴李腆泡虫1 SC/T 7223.2-2017 4.11 水平电泳系统。5 感染对象与临床症状5.1 感染对象吴李腆泡虫主要感染饵，还可感染链CHypophthalmi

4、chthysmolitrix)和马口鱼CO户5r时hthysbi-dens)。5.2 临床症状吴李腆泡虫一般寄生于僻的姆和肝膜脏，寄生于肝膜脏的危害较大;患病的鱼厌食，昏睡，身体消瘦，游动缓慢，直至慢慢死亡;病鱼腹部膨大，肝膜脏显著增大，乳白色;鱼死亡后，肝膜脏溶解。6 吴李破泡虫的采集、固定与标本制作6.1 病鱼采集观察待检鱼的临床症状和行为，采集具有典型症状的鱼，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符合SC/T7103的规定。6.2 样晶的采集剪开腹部，在肝膜脏中取出包囊团，或用吸管吸取服状物，置于培养皿中。6.3 样品的固定用10%中性福尔马林溶液(见A.l)固定茹抱子虫包囊团或抱子，或

5、用100%乙醇保存。6.4 样品的标本制作将妻自抱子虫样品置于载玻片上，在标本中加一滴水，或者滴加少许吉姆萨溶液(见A.2)，盖上盖玻片，用于显微镜观察。7 吴李确泡虫的鉴定7.1 吴李破泡虫形态学鉴定根据显微镜内的测微标尺测量抱子和极囊的大小，吴李腆泡虫抱子的形态特征见附录B。成熟抱子壳面现为梨形，缝面观呈厚梭形，前端略尖，后端钝圆，无薄膜销，亮瓣底部有1个3个V形榴皱;抱子长16.5m18.9m，宽9.1m10.8m，厚7.2m9.0 m。极囊2个，呈梨形，几乎等大，极囊长8.1m9.9m，宽3.4m4.0 m，约占抱子长度的1/2;极丝盘成7圈9圈。如果抱子的形态特征与上述描述相符，则可

6、判定为疑似吴李腆泡虫。7.2 吴李慎泡虫分子检测7.2.1 虫体DNA的提取将用100%乙醇固定的抱子(有包囊的用清水冲洗，去除表面组织)充分干燥去除乙醇，置于1.5 mL 的离心管中，加入0.5mL裂解缓冲液(见A.6)，550C下过夜。冷却至室温后，加入500LDNA抽提缓冲液(见A.7)，摇匀，5200g离心10min，收集上清液。然后加人O.1倍体积的乙酸铀缓冲液(见A.3)和2倍上清液体积的一200C预冷无水乙醇，40C下10000g离心10min弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清液，空气干燥后溶于40LTE缓冲液(见A.4)中，一200C保存备用。7.2.2 18S rDN

7、A的PCR扩增在50L的PCR反应体系中，包含模板基因组DNA10 ng50 ng、1.5 U Taq酶、1.5mmol/L的MgClz、0.2mmol/L的dNTPs、上游引物和下游引物各2mol/L、Taq酶缓冲液5L。无加热盖的PCR仪应滴加少许矿物油。在PCR扩增仪中，950C预变性5min，再950C50 s560C 50 s720C 1 min，共35个循环;最后720C延伸10min SC/T 7223.2-2017 PCR扩增时，应设置阴性对照(无虫体DNA模板)和阳性对照(含吴李腆泡虫DNA模板)。7.2.3 PCR产物电泳与测序取5LPCR产物，加人1L澳酣蓝指示剂溶液(见

8、A.10)，混匀，用1.0%琼脂糖凝胶(含0.05L/mL GoldView核酸染料)于TAE缓冲溶液(见A.的中电泳分离，同时设置DNA分子量标准做参照，紫外透射仪下检查是否存在大约1600bp的目的条带。如存在目的条带，则取PCR扩增产物测序，其序列见附录C。7.2.4 结果判定将所测定的18SrDNA序列与附录C中的序列进行比对分析，如果相似性在99.0%及以上者，则判定为吴李腆泡虫。8 综合判定8.1 吴李慎泡虫的判定如果黠抱子虫的形态鉴定符合7.1的要求，且分子鉴定符合7.2.4的要求，则判定为吴李腆泡虫。8.2 吴李破泡虫病的判定费即肝膜脏感染的虫体为吴李腆泡虫，且病鱼临床症状符合

9、5.2描述，则诊断为吴李腆泡虫病。3 SC/T 7223.2-2017 A.1 10%中性福尔马林溶液10mL甲醒溶液，加90A.3乙100 mL。将10g 保存。A.7 DNA抽提缓冲将Tris-HCl溶液饱和保存。A.8 Taq酶缓冲液(10倍PCRbuffer)附录A(规范性附录)试剂及其配制1)无菌去离子比例混合，密闭避光4.C0.5 mol/L pH8.8的Tris-HCl、0.5mol/L的氯化伺(KCl)和1%的TritonX-100的混合溶液。A.9 TAE电泳缓冲液(50倍)将242.0g Tris碱、37.2g Na2EDTA 2H20混合，然后加人800mL的去离子水充分

10、搅拌溶解，再加人57.1mL的冰乙酸，充分混匀，加去离子水定容至1L，室温保存。1)本附录所有试剂，除特别注明外，均采用分析纯的试剂。4 SC/T 7223.2-2017 A.10 澳酣蓝指示荆溶液取澳酣蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取煎糖25g，加双蒸水溶解后移人澳酣蓝溶液中，摇匀后加双蒸水定容至50mL，加入氢氧化铀CNaOH)溶液1滴，调至蓝色。5 SC/T 7223.2-2017 6 附录B(规范性附录)吴李慎泡虫袍子的形态特征吴李腆泡虫抱子的形态特征见图B.L2 a)壳面观说明:1-一-袍子长06.5m18.9m);2一一抱子宽(9.1m10.8m);3一一

11、袍子厚(7.2m9.0n);5m 6 3 b)缝面观4一一极囊长(8.1m9.9m);5一极囊宽(3.4m4.0时，6 极丝(7圈9圈)。图B.l吴李破泡虫抱子的形态特征SC/T 7223.2-2017 附录C(规范性附录)吴李破泡虫18SrDNA扩增产物的参考序列(GenBank登录号:EF690300)1 GATTATCTGT TTGATTGTCT TACCCATTGG ATAACCGTGG GAAATCTAGA GCTAATACAT 61 GCAGTTTATT GGCGTAGTCG CAAGATTGCG TCAAAGCATT TATTAGACTT AACCATCTAC 121 TGTAC

12、GCAAG TATAGTAAGG CGAATCTAGA TAACTTTGCT GATCGTATGG CCCTGTGCCG 181 ACGACGTTTC AATTGAGTTT CTGCCCTATC AATTTGTTGG TAAGGTATTG GCTTACCAAG 241 GTTGCAACGG GTAACGGGGA ATCAGGGTTC GATTCCGGAG AGGGAGCCTG AGAAACGGCT 301 ACCACATCCA AGGAAGGCAG CAGGCGCGCA AATTACCCAA TCTAGACAGT AGGAGGTGGT 361 GAAGAGAAGT ACTTAGTGGT GGC

13、CTAATGG TCCCAACTAG GAATGAACGT AATTTAAGCA 421 ATTCGATGAG TAACTACTGG AGGGCAAGTC CTGGTGCCAG CAGCCGCGGT AATTCCAGCT 481 CCAGTGGCGT GATTTAAAGT TGCTGCGTTT AAAACGCTCG TAGTTGGATC ACGCAGTAGC 541 ATACAGTTAC ACAGATTGGT TTATTTGACG ATTTTCTTTC AAAGATTATT GAATTTTGGC 601 TGGTCTGTGT GTTAACGCTG TATGCTGCTA TTTGCACACA A

14、GTATGGTAT TTGGCCTTTA 661 GTGAGTCGAG TATCATGTCT TGTGGGGTGT GCCTTGAATA AAACAGAGTG CTCAAAGCAG 721 GCGAACGCTT GAATGTTATA GCATGGAACG AACAAACGTG TATTTGCGTA TATTTGATAA 781 GGTCGAGGGC AACTTTGACC TGTTGGATAT ATGCAGCACC CGCCAAAATA CGGATGTTGG 841 TTTTCGTATA AGGTGATGAT TAACAGGAGC GGTTGGGGGC ATTGGTATTT GGCCGCGAGA

15、 901 GGTGAAATTC TTGGACCGGC CAAGGACTAA CAGATGCGAA GGCGTTTGTC TAGACCGTTT 961 CCATTAATCA AGAACGAAAG TGGGAGGTTC GAAGACGATC AGATACCGTC CTAGTTCCCA 1021 CTATAAACTA TGCCGACCTG GGATCAGTTT AGTGATTAAC AAGCACTAGG TTGGTCCCCC 1081 TGGGAAACCT AAAGTTTTTC GGTTACGGGG AGAGTATGGT CGCAAGTCTG AAACTTAAAG 1141 GAATTGACGG A

16、AGGGCACCA CCAGGGGTGG AGCCTGCGGC TTAATTTGAC TCAACACGGG 1201 GAAACTTACC TGGTCCGGAC ATCGAAAGGA TAGACAGACT GATAGATCTT TCTTGAAGCG 1261 GTGAGTGGTG GTGCATGGCC GTTCTTAGTT CGTGGAGTGA TCTGTCAGGT TTATTCCGGT 1321 AACGAACGAG ACCACTTTCT CCATTTAAGA AACGGTAGCA GGGAGTTGGC TTGAAATTGT 1381 TTCGGCAGTT TCGGGTTGAT TTTCGC

17、AGAT AGAATTGTTA AATTCCATGG AAGGGTGCTG 1441 AGGGGCAACC TGAGGTATTT GACTGTGGAA GGAGATGATT TTTCCTATCG TTATGCAGTG 1501 TAAGGCAAAA CCTTCACGCT GTCTTATGGA GAGACAACAG GTTTATAAAA GCCTGAGGAA 1561 GTGTGGCTAT AACAGG 7 中华人民共和国水产行业标准黠抱子虫病诊断规程第2部分:吴李慎泡虫叹/T7223.2-2017*关头中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销关关长开本880mmX1230mm 1/16 印张O.75 字数15千字2017年9月第1版2017年9月北京第1次印刷书号16109 4229 定价18.00元版权专有侵权必究举报电话(010)65005894