SN∕T 4344-2015 杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犃狆 狉 犻 犮 狅 狋犮 犺 犾 狅 狉 狅 狋 犻 犮犾 犲 犪 犳 狉 狅 犾 犾狆 犺 狔 狋 狅 狆 犾 犪 狊犿犪 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准起草人：黄新、侯立华、郭欣硕、牟海青、赵文军、张琪、张琰、朱水芳

2、、王有福。犛犖犜 杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法范围本标准规定了杏褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境杏、桃及李子苗木中杏褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定。杏褪绿卷叶植原体基本信息学名：犘犺狔 狋 狅 狆 犾 犪 狊犿犪狆 狉 狌 狀 狅 狉 狌犿异名：；分类地位：软壁菌门，柔膜菌纲，无胆甾原体目，无胆甾原体科，植原体候选属，植原体组。传播途径：田间近距离扩散以媒介叶蝉（）和嫁接传播为主，远距离以无症带菌苗木传播为主。杏褪绿卷叶植原体的其他信息参见附录。方法原理杏褪绿卷叶植原体的生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据，荧光染色法和透射电子显微镜法在本标准中作为一种初步

3、筛选植原体的方法；技术与技术结合作为鉴定杏褪绿卷叶植原体的准确方法。仪器设备和主要试剂 仪器设备仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、透射电子显微镜、荧光显微镜。主要试剂植原体细胞富集缓冲液（）：无水磷酸氢二钾 ，磷酸二氢钾 ，蔗糖，牛血清白蛋白 ，聚乙烯吡咯烷酮，维生素 ，用 的调节值至。提取缓冲液：十六烷基三甲基溴化铵（左右溶解），氯化钠，乙二胺四乙酸，（）。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。病菌的鉴定 症状检查仔细观察寄主植物种苗、叶片等，感病植株典型症状是卷叶，叶片沿着从叶柄到

4、叶尖的直线卷曲，叶犛犖犜 片脉间失绿，不规则或形成圆锥形或多角形轮廓。症状描述参见附录。犇犃犘 犐染色选取幼嫩组织（叶脉、侧芽），切片，用 溶液（，二脒基 苯基吲哚）染色，在 激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。通用引物犘犆犚凝胶电泳及犚犉犔犘检测按附录提取。通用引物凝胶电泳及检测见附录。特异性引物犘犆犚凝胶电泳检测特异性引物凝胶电泳检测见附录。植原体形态观察对采集的植物样品制备超薄切片，通过透射电镜观察植原体形态方法（见附录）。结果判定 表现症状与 描述一致，并且 染色观察结果显示蓝

5、色荧光或者电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可初步判定为植原体。在 检测中，若产物凝胶电泳检测结果为阳性，而且分析片段大小与描述相符，可判定该样品携带 组的植原体。在 检测中，若通过 、引物扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，在 处检测到特异性扩增条带，可判定该样品携带杏褪绿卷叶植原体。样品保存 样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出杏褪绿卷叶植原体的样品应保存于 冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。凝胶电泳检测需有电泳结

6、果照片。复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。犛犖犜 附录犃（资料性附录）杏褪绿卷叶植原体其他相关信息犃 形态特征形态为杆状或者球形颗粒，是在大小和形态上可变的多形性结构。犃 症状特征感病植株典型症状是卷叶，叶片沿着从叶柄到叶尖的直线卷曲，叶片脉间失绿，不规则或形成圆锥形或多角形轮廓。该病原物也能侵染李树，症状与感病杏树相似但不典型，叶片小、红色，形成圆柱状卷曲。犃 寄主范围寄主主要是杏、桃和李子，此外，也能寄生在一些杂草如田旋花和狗牙根自然寄主上。犃 分布除了在南非未经证实外，杏褪绿卷叶植原体在欧洲被发现。法国（

7、杏栽培地区普遍存在）、德国、希腊、意大利、匈牙利、罗马尼亚、西班牙、瑞士等均有分布。犛犖犜 附录犅（规范性附录）植原体犇犖犃的提取犅 植原体细胞的富集称取新鲜样品叶中脉，加入新制备的提取缓冲液，的石英砂，于研钵中研磨。冰上放置 ，加入相同的缓冲液并摇晃均匀；将悬浊液转移至 离心管，使用预冷的离心转头（）离心，将上清液移至另一个离心管中，离心 ，干燥沉淀并用 预热的溶液，重悬沉淀；水浴中温浴 ，将的溶液转至干净的的微管中，用于接下来的提取。犅 犇犖犃提取将植原体细胞富集液转移至离心管。加入提取缓冲液；将离心管置于 水浴中温浴，每隔 左右将离心管颠倒混匀；，离心；将离心后的上清液转移至一个新的离心

8、管中，加入三氯甲烷异戊醇（），混匀，形成乳浊液；将乳浊液在 ，离心；将上清液转入新管，加入 ，温浴 ；加入三氯甲烷异戊醇（），离心；上清液转入新管，加入 预冷的异丙醇，离心 ；弃上清液，加入 的 的乙醇，在 ，离心；弃掉上清液，干燥沉淀，加入 的灭菌蒸馏水溶解。其他的提取方法也可以借鉴，也可以选择使用商业提取试剂盒，提取的在 的条件下可以冻存一年。犛犖犜 附录犆（规范性附录）通用引物犘犆犚扩增以及犚犉犔犘分析犆 引物序列植原体通用引物：，：。犆 犘犆犚反应体系及参数犆 犘犆犚反应体系见表。表犆 犘犆犚反应体系试剂名称终浓度 反应缓冲液 正向引物 反向引物 犜犪 狇聚合酶 模板补至 注：模板的取

9、量应根据的提取浓度、纯度而调节。犆 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置犆 阴性对照：以健康的杏叶片为模板。犆 阳性对照：以携带有杏褪绿卷叶植原体 序列的为模板。犆 空白对照：设两个，一是提取时设置的提取空白对照（以代替样品），二是反应的空白对照（以代替模板）。犆 犘犆犚的反应参数 ：；，个循环；。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。犆 琼脂糖凝胶电泳制备的琼脂糖凝胶，以 作为分子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像犛犖犜 仪观察并记录结果，分子大小 左右。犆 犚犉犔犘分析所用限制性内切酶为犃犾 狌，反应体系：总体系；缓冲液，犃犾 狌，的产物。置于 温育至少，电泳同。犆 结果判

10、断对犡组 序列用犃犾 狌分析，其共有序列为 、和 。可判定该样品携带杏褪绿卷叶植原体或 犡组的成员。犛犖犜 附录犇（规范性附录）特异性引物犘犆犚凝胶电泳检测犇 特异性引物序列 ：，：。犇 犘犆犚反应体系同 。犇 犘犆犚的反应参数 ：；，个循环；。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。犇 琼脂糖凝胶电泳同。犇 结果判定琼脂糖凝胶电泳出现 的特异性扩增片段，可以判定所测样品携带杏褪绿卷叶植原体。犛犖犜 附录犈（规范性附录）透射电子显微镜观察犈 试剂试材犈 锇酸固定液巴比妥乙酸钠缓冲液的锇酸固定液巴比妥钠 乙酸钠 加双蒸水至 取锇酸水溶液 液 盐酸 加双蒸水至 。混合后用 盐酸调至为，即为

11、锇酸固定液，在冰箱保存备用。犈 戊二醛固定液一般为 戊二醛水溶液。可配制在除巴比妥以外的任何缓冲液中使用，终浓度为。犈 环氧树脂 顺丁烯二酸酐（）令苯二甲酸二丁酯（）二乙基苯胺（）将 倒入烧杯中，置 温箱融化备用。按上述比例，顺序加入，充分搅拌，待融化呈透明，至室温，再加入邻苯二甲酸二丁酯，仔细搅拌，然后慢慢逐滴加入二乙基苯胺，边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。犈 犉 狅 狉犿狏 犪 狉膜将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成 溶液，存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插入溶液中，取出倾斜待三氯甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，然后将玻璃倾斜放入蒸馏水中，薄膜即从玻璃片上脱落下来漂浮于水面，取干净的铜网摆

12、上，压紧，再用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养皿干燥备用。犈 实验步骤犈 取材选取呈现早期症状的杏褪绿卷叶植原体叶子，用刀片切成整齐的细条，大小为。取健康杏叶做对照。犛犖犜 犈 固定采用戊二醛锇酸双固定法。样品在 戊二醛进行前固定后，（）清洗三次，然后用锇酸后固定，清洁三次。犈 脱水采用乙醇和系列梯度脱水。乙醇 乙醇 乙醇 丙酮 丙酮 丙酮 。样品可在 乙醇中停留过夜。犈 渗透脱水后的组织块在丙酮树脂中渗透，再在全树脂中渗透。犈 包埋用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴入包埋剂。于 下，下。犈 切片在超薄切片机上将固定的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有 膜的铜

13、网捞起，置培养皿内干燥、保存。犈 切片染色采用乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸铀染液滴入蜡盘上。取带切片的铜网，插入染色滴中，染 ，然后取出铜网，蒸馏水洗去多余染色液滤纸吸干。将铜网再放入另一蜡盘，滴入柠檬酸铅染液，使铜网翻扣在染色液上，染 ，再用 氢氧化钠漂洗干净，滤纸吸干。犈 显微镜观察透射电子显微镜观察植原体形态。犛犖犜 书 书 书 犜犖 犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元