NY∕T 3152.1-2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第1部分：鸟类毒性试验(农业).pdf

《NY∕T 3152.1-2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第1部分：鸟类毒性试验(农业).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NY∕T 3152.1-2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第1部分：鸟类毒性试验(农业).pdf（15页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3152.1-2017 微生物农药环境风险评价试验准则第1部分:鸟类毒性试验Risk assessment test guidelines for microbial pesticide一Part 1:A vian toxicity test 2017-12-22发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 3152.1-2017 目IJ1=1 NY/T 3152(微生物农药环境风险评价试验准则分为6个部分:一一第1部分:鸟类毒性试验;一-第2部分:蜜蜂毒性试验;一一第3部分:家蚕毒性试验;第4部分:鱼类

2、毒性试验;一一第5部分:渣类毒性试验;第6部分:藻类生长影响试验。本部分为NY/T3152的第l部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部种植业司提出并归口。本部分起草单位:农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:程燕、曲甏在、卡元卿、周艳明、张俊、吴声敢、单正军。I 1 范围微生物农药环境凤险评价试验准则第1部分:鸟类毒性试验本部分规定了微生物农药对要求。本部分适用于微生2 规范性引用文件3.1 微生物是以细菌、有害生物作用3.2 供试物试验中NY/T 3152

3、.1-2017、试验报告等的基本于本文细菌芽泡、真茵抱子、细菌到物范震唱起cter酒喝阜Is撞-acterialor protozoan cyst 显微镜下一个完整的个体芽掘矗血囊，通常是指能在合温事基上形成单个CFU的一个完整的实体。细菌营养体vegetative bacterium 单个活的生物体，通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.6 原生生物protozoa 原生生物门各个成员的一个完整的营养体、于包子或抱囊。3.7 病毒virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。l NY/T 3152.1-2017 3.8 最大危害暴露量maximum hazard e邓osur

4、elevel 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量，通常以预测暴露量与安全系数的乘积来表示。3.9 毒性toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力，其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复制和生命活动。3.10 致病性pathogenicity 微生物感染宿主后，在宿主体内存活及繁衍，对宿主造成损伤或病变的能力，通常与宿主的耐受性或敏感性有关。3.11 半数致死量median lethal do西eor concentration,LD5O/LC5O 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数死亡所需最小微生物数量或毒素量。3.1

5、2 半数感染量median infective d脱orconcentratEOEhmJIC目在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数感染所需最小微生物数量或毒素量.4 试验概述在一定试验条件下，以一定的供试物浓度或剂量测试对受试鸟的致死毒性和致病性等影响。当供试物最大危害暴露量试验出现对受试生物50%及以上的个体死亡或致病时，则还需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验。致死毒性以LD50表征;致病性以10，0值表征。5 试验方法5.1 材料和条件5.1.1 试验生物推荐物种为日本鹊鸦CCoturnixcoturnix ja户onica)、野鸭CAnasplatyrhyn

6、chos)、北美鹊鸦CColi-nus virginianus)、鸽子CColumbalivia)等的幼鸟(孵化后14d24 d，且试验开始时受试鸟之间体重差别不超过10%)。受试鸟健康状况良好，引人实验室后7d内的死亡率应5%。5.1.2 供试物5.1.2.1 类型微生物母药、制剂产品等。5.1.2.2 批次通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报告中记录供试物的批次。5.1.2.3 计蚊方法计数方法如下:细菌可采用稀释平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定;真菌抱子以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定;2 NY/T 3

7、152.1-2017 一一原生动物以个体数目为计数单位，可采用血球计数板法等测定;一一病毒以包涵体等感染单位为计数单位，可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定;一-其他单位，根据微生物的类型和特性选择最适当的计数方法.以上推荐计数方法，参见附录A、附录B、附录C。5.1.3 主要仪器设备超净工作台。灭菌锅。显微镜。解剖镜。分光光度计。聚合酶链式反应仪。试验用鸟笼。温湿度计。玻璃容器。天平等。5.1.4 试验条件受试鸟类5.2.3 效应观察试验期间每日反应时认为鸟已死亡。5.2.4 试验周期通常试验观察时间应持续30则需延长观察时间，直至能够判5.2.5 最大危害暴露量试验。考虑微激产生开始出

8、现死亡或明显病征，以下列不同暴露途径设置供试物最大危害暴露量。当因制剂剂型等条件限制，供试物溶液浓度不能达到最大危害暴露量时，则以供试物在水中能配制到的最大浓度进行试验。试验开始后，每日观察并记录受试鸟的中毒症状及死亡情况。当受试鸟在试验期间未发生死亡(病变)或死亡(病变)率不超过50%，则无需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验。经口暴露和腹腔注射暴露的暴露量计算如下:a)经口暴露量。最大危害暴露量按式。)计算。Dose=CXVo.IXW.(l)式中:Dosemax一一最大危害暴露量，单位为微生物数量(units);3 NY/T 3152.1-2017 C一一供试微生物农药配制浓度，单位为微

9、生物数量每毫升(units/mL);V时一一受试鸟单位体重经口暴露时摄入农药体积，单位为毫升每千克(mL/kg)，取值为5mL/kg;W一一受试鸟体重，单位为千克(kg)。供试微生物配制浓度为1.OX 108单位/mL，或按供试微生物农药推荐施用浓度的10倍计算(两者均能达到时，取较高值为配制浓度)。以此经口最大危害暴露量连续5d经口给药，然后正常饲喂直至试验结束。b)腹腔注射暴露量，最大危害暴露量按式(2)计算。Dos乌田二CXV叫回回 xw(2)式中:Vinj能阳一一受试鸟单位体重经口腹腔注射时摄入农药体积，单位为毫升每千克(mL/kg)，取值为2mL/kg.供试微生物农药配制浓度为1.0

10、X108单位/此，或按供试微生物农药推荐施用浓度的10倍计算(两者均能达到时，取较高值为配制浓度。以此腹腔注射最大危害暴露量一次性腹腔注射，然后正常饲喂直至试验结束。5.2.6 剂量效应试验根据最大危害暴露量试验结果，按一定比例间距设置5组7组供试物系列浓度，将受试鸟暴露于不同浓度的供试物下。试验开始后，每日观察并记录受试鸟的中毒症状及死亡情况，求出试验结束时供试物对受试鸟类的LDso或ID，o及其95%置信限。5.2.7 致死(病)验证试验在元菌条件下解剖死鸟或病鸟，分离感染组织并接种至适合的培养基中，将培养物置于适宜目标菌株生长条件下培养，分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸

11、等方法鉴定并确认为目标菌株后，再以相同暴露途径感染健康的受试鸟。如果受试鸟出现与先前试验相同的病症，则证实目标菌株对鸟类具有致死(病)能力。5.3 数据处理5.3.1 统计方法选择试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适的统计方法。5.3.2 差异显著性检验5.3.2.1 概述差异显著性检验推荐采用独立样本t检验或单因子方差分析(One-WayANOVA,LSD检验)等。显著水平取0.05(差异显著)、pO.Ol(差异极显著。5.3.2.2 独立样本t检验2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(3)计算。.(3)式中2X1,

12、X2 分别为两样本平均数;式，f2分别为两样本方差;n 一一样本容量。5.3.2.3 One-Way ANOVA方差分析(LSD检验)NY/T 3152.1-2017 3组及以上均值比较时可进行方差分析。LSD检验按式(4)计算。LSD.=t.w.Si，(份式中:t.df.一一在F检验中误差自由度下，显著水平为的临界t值;Si.-玉，一一均数差异标准误，按式(5)计算。Sh，=d丽.!可.式中:MS，-F检验中误差均方En 一一各处理重复数。5.3.3 半数致死量或半鸟类半数致死量LDso算，也可巾用古事扑酣，-l0iii5.4 质量控制6 息，一一受试生物一一试验系-一试验条件，一一试验结果

13、。概率单位图解法估组成信5 NY/T 3152.1-2017 附录A(资料性附录)稀释平板菌落计数法1)A.1 方法原理将供试物经无菌水分散处理后，在固体培养基上由单个细胞生长并繁殖成一个菌落，因而可以根据形成的菌落数来计算供试物中微生物的数量。A.2 试剂蛋白陈。牛肉膏。氯化纳(NaCI)。氢氧化纳溶液:1mol/L.盐酸溶液:1 mol/L。葡萄糖。磷酸二氢惆(KH，PO，)。硫酸缓(MgSO，)。琼脂。孟加拉缸。蒸馆水。氯霉素。A.3 仪器设备高压蒸汽灭菌锅。恒温培养箱。超净工作台。酸度计等。A.4 固体培养基平板的制备A.4.1 细菌培养基平板依次称取蛋白陈10g、牛肉浸膏3g、氯化锅

14、5g、琼脂15g18g，溶于900r蒸馆水中，置于电炉4 上加热，搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL.以1mol/L氢氧化锅溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07.2。分装于500mL三角瓶中，每瓶装150mL，塞上棉塞，经121.C高压蒸汽灭菌20min,培养基温度降至约50.C后倒入无菌培养皿中，每板约15mL.A.4.2 真菌培养基平板依次称取蛋白陈5g、葡萄糖10 g、磷酸二氢饵1g、硫酸馁。.5g，琼脂15g18 g、孟加拉红0.03g、氯霉素0.1 g，溶于900mL蒸馆水中，置于电炉上加热，搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL.分装于1)本方法适用于细菌、真酶袍子等计

15、数.但细菌、真菌袍子等计数不仅限于本方法.6 NY/T 3152.1-2017 500mL三角瓶中，每瓶装150mL，塞上棉塞，经121C高压蒸汽灭菌20min，培养基温度降至约50C后倒入无菌培养皿中，每板约15mL。A.5 样品的处理称取一定量的供试物，加入盛有适当无菌水的三角瓶中，通过振荡、超声等方法使供试物充分分散成单细胞，形成菌悬液，然后用容量瓶和无菌水定容，配置一定浓度的微生物悬浮母液备用。上述过程均应无菌操作.A.6 样品母液的稀释涂布用无菌刻度吸管吸取1mL上述配制好的微生物悬浮母液到9mL元菌水中，按10倍法依次稀释，细茵通常稀释到10-8，并选择10-8_10-6稀释菌悬液

16、用于平板涂布;真茵通常稀释到10-7，并选择10-7-10稀释菌悬液用于平板涂布。吸取100L稀释液置于培养基平板表面，立即用无菌玻璃涂棒或接种针均匀涂抹于培养基表面，将涂布后的平板倒置于温度适宜的培养箱中黑暗培养。当用同一支吸管接种同一样品不同稀释浓度时，应从高稀释度(即低浓度菌悬液)开始，依次向较低稀释度的菌悬液顺序操作。A.7 菌落计数细菌培养基平板培养2d-3 d后取出，选择细菌菌落数量20-200之间的培养皿进行计数。真菌培养基平板培养3d-5 d后取出，选择真菌菌落数量10-100之间的培养皿进行计数。母液微生物浓度或含量计算按(A.1)计算。C=NX X(A.1)式中:C一一母液

17、微生物浓度或含量，单位为菌落形成单位每克(CFU/g)或菌落形成单位每毫升(CFU/mL);N一一培养基平板微生物菌落平均数，单位为个;X一一母液稀释倍数。7 NY/T 3152.1-2017 B.1 方法原理B.2 B.3 B.4 少许，从计数区，并用行计数。B.5 数量计擞附录B(资料性附录)血球计数板法1)，用滴管吸取的表面张力充满。在显微镜下进计数时若计数区是由监古格缰酣啸曾对角 理守在，数左昧、右下、右上、中间的5个中方格(p80小格的微生物数。jllS_1II监幽确性l且.阳二样品至少计数2次，对沉降在格线上微生物的统计应有统一的规定。如破主工二工工7百五线上，计数时则数上线不数下

18、线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的微生物计入本格，本格的下线和右线上的微生物按规定计人相应的格中。8 样品浓度或含量按式(B.1)计算。C=N X 25/5 X 10 X 103 X X.(8.1)式中:C一一样品浓度或含量，单位为个每毫升(个/mL);1)本方法适用于体型较大的微生物，如真菌袍子、薛母、多角体病毒和原生动物等计数.但真菌抱子、酵母、多角体病毒和原生动物等计数不仅限于本方法.N一-5个中方格的微生物总数;x-一一样品稀释倍数。NY/T 3152.1-2017 9 NY/T 3152.1-2017 C.1 方法原理SYBR Green 正相关。因此，参照标准

19、曲C.2 C.3 C.4 C.4.1目附录C(资料性附录)荧光定量PCR法叫光信号强度与dsDNA的数量号累积曲线，最后通过引物设计黠时翻幽国际屋营圈圈嗖雪i洼.0设计引物，使引物Tm值为62.C6样品基因组总咱提躏罐罐样榻墨雪剂盒，眶因组提取试剂盒操作说明提取样品基因组特异基因片段扩增:颜.且同事酶总而蹦眩，P特异基因片段，采用两步法扩增，PCR扩增体系如下:rTaq酶嘲皿.iaq酶10X且iIIIIL，dNTP2L(20mmol/L)，寻|物1(Pl)、引物2(P2)各lL，模板lE宵愤主25L;反应条件为:94.C预变性5min;(94.C变性，30s;60.C退火延伸30s)30个循环

20、;72.C充分延伸10min;4.C保存。电泳检测:PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，确保无非特异性扩增并回收扩增片段。TA克隆:按照TA克隆标准步骤将回收后的扩增产物连接至pMD18T载体并转化至大肠杆菌DH5a感受态中;LB抗性平板(Amp100)结合蓝白斑筛选，挑取单克隆转移至液体LB(Amp100)中，37C摇床培养12h，按照质粒提取试剂金说明书提取质粒并送至1则序公司进行测序验证，确定目的基因片段与载体相连且序列正确。C.4.2 标准品模板的拷贝蚊确定1)本方法适用于细商、真商和l病毒等计数.但细菌、真菌和病毒等计做不仅限于本方法.10 NY!T 3152.1-2017 使用N

21、anodrop或其他仪器测定含目的基因片段的载体浓度，按照式(C.l)计算目的基因拷贝数(Copies!L).Q=6.02XlOZ3 XCX10-!LX660(C.1)式中:Q一一基因拷贝数，单位为拷贝数每微升(Copies!L);C一-DNA浓度，单位为纳克每徽升(ng!L);L-DNA长度，单位为碱基对(b抖。将含目的基因片段的载体用ddHzO进行10倍梯度稀释，稀释为10Copies!L-108 Copies!L，此即为标准品模板，一20.C保存样品。C.5 标准曲线绘制与扩增效率计算标准品模板的qPCR扩增:采用20LqPCR反应体系，两步法进行扩增，具体为:标准品模板2L，SYBR

22、Green Superrnix 10L，引物1和引物2各lL，加元菌双蒸水补足体积至20L;反应条件为:95.C预变性5min;(95.C变性，10s;60.C退火延伸30s)40个循环;溶解曲线采集程序以程序默认为准;其中，每个稀释度的样品做5个重复，阴性对照使用无模板的无菌双蒸水。标准曲线的绘制:确定溶解曲线为单峰，且峰值温度在80.C-90.C，确定溶解曲线峰值;并确定扩增生成Ct值在15-35区域间，同一个样品不同重复间的Ct值差异小于O.趴在满足此条件的情况下，以标准品模板的拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，并求出标准曲线线性方程。扩增效率(E)计算:E的范围应为90%-

23、1l0%，保证qPCR每完成一个循环，底物浓度扩增一倍;E按式(C.2)计算.E=OO一l/k_1)X100.(C.2)式中:E 扩增效率，单位为百分率(%);k一一标准曲线斜率。C.6 样品微生物的定量C.6.1 样晶总基因组DNA的提取根据基因组提取试剂盒说明书提取样品基因组总DNA.C.6.2 样晶微生物计数以提取的样品基因组总DNA为模板，进行qPCR反应。qPCR反应条件与C.5一致，根据反应生成的Ct值和已建立的标准曲线，计算各目的基因片段的拷贝数，从而评估样品中待测物种的丰度，11 NY/T 3152.1-2017 参考文献lC;B 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生

24、物学检验菌落总数测定.2NY/T 2743-2015 甘煎白色条纹病菌检验检疫技术规程实时荧光定量PCR法.3SN/T 2358-2009 国挠口岸炭瘟芽抱杆菌荧光定量PCR检测方法.12 EON-F.NmF凹H如Z中华人民共和国农业行业标准微生物农药环境凤险评价试验准则第1部分:鸟类毒性试验NY/T 3152.1-2017 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼(由E政编码，100125 网址)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销祷*祷开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张1.25 字数25千字2018年5月第1版2018年5月北京第1次印刷书号16109 4422 定价30.00元 版权专有侵权必究举报电话(010)65005894