SC∕T 7223.3-2017 黏孢子虫病诊断规程 第3部分：武汉单极虫(水产).pdf

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1、ICS 65.020.30 B 41 4H 中华人民共和国水产行业标准SC/T 7223.3一2017黠子包子虫病诊断规程第3部分:武汉单极虫Protocols for diagnosis of myxosporidiosis-Part 3:Disease caused by Thelohanellus wuhanensis 2017-06-12发布2017-10-01实施导二二t咱中华人民共和国农业部发布SCjT 7223.3一2017.剧昌SCj T 7223(黠抱子虫病诊断规程拟分为如下部分:一一第1部分:洪湖腆泡虫;一一第2部分:吴李腆泡虫;一一第3部分:武汉单极虫;一一第4部分:吉陶

2、单极虫。本部分为SCjT7223的第3部分。本部分按照GBjT1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部渔业渔政管理局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(SACjTC156)归口。本部分起草单位:中国科学院水生生物研究所。本部分主要起草人:李文样、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明。I 范围本部分给出了饵CCarassius汉单极虫(Thelohanellus 汉单极虫病的综合判定。本部分适用于挪2 下列文件对件。凡是不注GBj T 6 SCj T 7 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 上游引下游引本

3、对引3.6 DNA 3.7 其他试剂见附4 仪器和设备4.1 解剖盘、剪刀、慑子、解4.2 体视显微镜和带测微标尺的4.3 盖玻片、载玻片和培养皿。4.4 电子天平。蒙古子包子虫病诊断规程第3部分:武汉单极虫4.5 普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6 普通冰箱。4.7 微量移液器。4.8 PCR扩增仪。4.9 离心管和PCR管。4.10 紫外透射仪或凝胶成像系统。SCj T 7223.3-2017 抱子虫病)的临床症状，规定了武和分子检测的方法，以及武1 SCjT 7223.3-2017 4.11 水平电泳系统。5 感染对象与临床症状5.1 感染对象武汉单极虫感染侧。5.2 临床症状武汉单

4、极虫一般寄生于僻的体表鳞片下组织和鳝条，寄生于鳞片下的危害较大，可导致鱼苗的死亡。病鱼鳞片被包囊顶起，形成椭圆形凸起。6 武汉单极虫的采集、固定与标本制作6.1 病鱼采集观察待检鱼的临床症状和行为，采集具有典型症状的鱼，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符合SCjT7103的规定。6.2 样晶的采集在鳞片隆起处，用慑子取下鳞片，然后将包囊移出，置于培养皿中。6.3 样品的固定用10%中性福尔马林溶液(见A.l)固定蒙古抱子虫包囊团或抱子，或用100%乙醇保存。6.4 样晶的标本制作将茹抱子虫样品置于载玻片上，在标本中加一滴水，或者滴加少许吉姆萨溶液(见A.2)，盖上盖玻片，用于显微镜观察。7

5、 武汉单极虫的鉴定7.1 武汉单极虫形态学鉴定包囊近球形，乳白色，表面有黑色斑点。根据显微镜内的测微标尺测量抱子和极囊的大小，武汉单极虫抱子的形态特征见附录B。成熟抱子壳面观为梨形，缝面观呈厚梭形，前端略尖，后端钝圆，薄膜鞠仅包围抱子后部，亮瓣底部有1个4个V形榴皱;抱子长21.0 f.lm25.0 m，宽12.0 m15.0 m，厚10.0m12.5m;极囊1个，近球形，极囊长9.0 m12.3m，宽7.0m9.7m;极丝盘成8圈10圈。如果抱子的形态特征与上述描述相符，则可判定为疑似武汉单极虫。7.2 武汉单极虫分子检测7.2.1 虫体DNA的提取将用100%乙醇固定的抱子(有包囊的用清水

6、冲洗，去除表面组织)充分干燥去除乙醇，置于1.5 mL 的离心管中，加人0.5mL裂解缓冲液(见A.6)，550C下过夜。冷却至室温后，加人500LDNA抽提缓冲液(见A.7)，摇匀，5200g离心10min，收集上清液。然后加人O.1倍体积的乙酸纳缓冲液(见A.3)和2倍上清液体积的一200C预冷无水乙醇，40C下10000g离心10min弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清液，空气干燥后溶于40LTE缓冲液(见A.的中，一200C保存备用。7.2.2 18S rDNA的PCR扩增在50L的PCR反应体系中，包含模板基因组DNA10 ng50 ng、1.5UT，q酶、1.5 mmol/

7、L的MgC12、0.2mmol/L的dNTPs、上游引物和下游引物各2mol/L、Taq酶缓冲液5L。无加热盖的PCR仪应滴加少许矿物油。在PCR扩增仪中，950C预变性5min，再950C50 s560C 50 s720C 1 min，共35个循环;最后720C延伸10min。SC/T 7223.3-2017 PCR扩增时，应设置阴性对照(无虫体DNA模板)和阳性对照(含武汉单极虫DNA模板)。7.2.3 PCR产物电泳与测序取5LPCR产物，加人1L澳酣蓝指示剂溶液(见A.10)，混匀，用1.0%琼脂糖凝胶(含O.05 L/mL GoldView核酸染料)于TAE缓冲溶液(见A.的中电泳分

8、离，同时设置DNA分子量标准做参照，紫外透射仪下检查是否存在大约1600bp的目的条带。如存在目的条带，则取PCR扩增产物测序，其序列见附录C。7.2.4 结果判定将所测定的18SrDNA序列与附录C中的序列进行比对分析，如果相似性在99.0%及以上者，则判定为武汉单极虫。8 综合判定8.1 武汉单极虫的判定如果茹抱子虫的形态鉴定符合7.1，且分子鉴定符合7.2.4，则判定为武汉单极虫。8.2 武汉单极虫病的判定哪体表感染的虫体为武汉单极虫，且病鱼临床症状符合5.2描述，则诊断为武汉单极虫病。3 SC/T 7223.3-2017 A.l 10%中性福尔马林溶液10mL甲醒溶液，加90A.2 吉

9、姆萨(Giemsa)100 mL。将1水定容至1将10g 保存。A.7 DNA抽提缓冲将Tris-HCl溶液饱保存。A.8 Taq酶缓冲液(10倍PCRbuffer 附录A(规范性附录)试剂及其配制1)菌去离子0.5 mol/L pH 8.8的Tris-HCl、0.5mol/L的氧化御(KCD和1%的TritonX-100的混合溶液。A.9 TAE电泳缓冲液(50倍)将242.0g Tris碱、37.2g Na2EDTA.2H20混合，然后加人800mL的去离子水充分搅拌溶解，再加人57.1mL的冰乙酸，充分混匀，加去离子水定容至1L，室温保存。1)本附录所有试剂，除特别注明外，均采用分析纯的

10、试剂。4 SC/T 7223.3-2017 A.10 滇酣蓝指示剂溶液取澳酣蓝100mg，1JO双蒸7.1.5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔚糖25g，加双蒸水溶解后移人澳酣蓝溶液中，摇匀后加双蒸水定容至50mL，加入氢氧化铀(NaOH)溶液1滴，调至蓝色。5 SC/T 7223.3-2017 6 附录B(规范性附录)武汉单额虫抱子的形态特征武汉单极虫抱子的形态特征见图B.l。2 a)壳面观说明:1一一-袍子长(21.0m-25.。m);2一一袍子宽02.。m-15.0m);3 抱子厚(10.0m-12.5m);4一一一极囊长(9.。m-12.3m);6 7 10m 3 b)缝面观5-一极

11、囊宽(7.。m-9.7m);6 极丝(8圈-10周);7-一薄膜销。图B.1 武汉单极虫抱子的形态特征SC/T 7223.3-2017 附录C(规范性附录)武汉单极虫18SrDNA扩增产物的参考序列GenBank登录号:J686871 ACCGTGGGAA TCTAGAGCTA ATACGTGCAG TTCATTGGCT CATCTTCGGG TGGGTCAAAG 61 CATTTATTAG ACTAAACCAT CTACTATGCT TGCATAGTAA GGGGAATCTG GATAACTTTG 121 CTGATCGTAT GGCCTCGTGC CGGCGACGTT TCAATTGAGT

12、 TTCTGCCCTA TCAACTTGTT 181 GGTAAGGTAT TGGCTTACCA AGGTTGCAAC GGGTAACGGG GAATCAGGGT TCGATTCCGG 241 AGAGGGAGCC TGAGAAACGG CTACCACATC CAAGGAAGGC AACAGGCGCG CAAATTACCC 301 AATCTAGACA GTAGGAGGTG GTGAAGAGAA TTACTAGGTG GTGACTCAAT GAGTTACCAG 361 TTTGGAATGA ACGTAACTTA AGAAATTCGA TGAGAAACAA CTGGAGGGCA AGTCCTGG

13、TG 421 CCAGCAGCCG CGGTAATTCC AGCTCCAGTA GTTTGCTTTA AAGTTGTTGC GTT1、AAAACG481 CTCGTAGTTG GATCACGCAG CAGTGCTCAG TAATCTGCTG CCTGACTTCG ACCAATGAAA 541 CCCACTTCTG TGGCCTTTCG GTAGCTGTCG GCAGTAGATG CCAACGCTGA GCACTGTTAG 601 TTGCACGTGA GATGAATTGT TGGCCTTTAT TGAGCCGGTA TTCTCGTCTT GCGGAGTGTG 661 CCTTGAATAA AA

14、CAGAGTGC TTAAAGCAGG TCATTGCCTG AATGTTATAG CATGGAACGA 721 ACAATCGTGT ATATGTATGC ATCCTTGAAT GGTGATGAGC CTTAGGTTTG TTGTTACTCA 781 GGATGCATAC GGCACCCACC AAAATATGGC TGTTGGTTCC ATATACGGTG ATGATTAAAA 841 GGAGCGGTTG GGGGCATCGG TATTTGGCCG CGAGAGGTGA AATTCTTAGA CCGGCCAAGG 901 ACTAACAAAT GCAAAGGCAC TTGTCTAGAC

15、CGTTTCCATT AATCAAGAAC GAAAGTGGGA 961 GGTTCGAAGA CGATCAGATA CCGTCCTAGT TCCCACTGTA AACTATGCCG ACCTGGGATC 1 021 AGTTTAGAGA TGTTACAAGC TCTAGATTGG TCCCCCTGGG AAACCTGAAG TTTTTCGGTT 1 081 ACGGGGAGAG TATGGTCGCA AGGCTGAAAC TTAAAGGAAT TGACGGAAGG GCACCACCAG 1 141 GGGTGGAGCC TGCGGCTTAA TTTGACTCAA CACGGGGAAA CTT

16、ACCTGGT CCGGACATCG 1 201 ATAGGATTAA CAGATCGATA GCTCTTTTAT GATGCGATGA GTGGTGGTGC ATGGCCGTTC 1 261 TTAGTTCGTG GAGTGATCTG TCGGCCTAAT TGCGGTAACG AACGAGACCA TAGTCTCCAT 1 321 TTAAGAAATA GAAGCAGACG AAGGGCGGCG TGGAATCGCA AGATTCTACT CGTCCGGCGT 1 381 TGTAGGTCGG ATTATGCGTT GCATTGTCAG AGTCTTGGGG TCiAACCTGA GGTT

17、TTGATG 1 441 GTGCGATGTA TTTTCTCCCT TCTATTAAGC AGCAATTGGT TTCGACTGAT TGTTGCCTTA 1 501 TGGAGAGACA ACGAGGTATA AACAA 7 中华人民共和国水产行业标准黯抱子虫病诊断规程第3部分:武汉单极虫叹:/T7223.3-2017 争导每争等中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址.ccap.CO)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*关开本880=X1230=1/16 印张O.75 字数15千字2017年9月第1版2017年9月北京第1次印刷书号16109 4230 定价18.00元版权专有侵权必究举报电话(010)65005894