SC∕T 7223.4-2017 黏孢子虫病诊断规程 第4部分：吉陶单极虫(水产).pdf

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1、ICS 65.020.30 B 41:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7223.4-2017 黠抱子虫病诊断规程第4部分:吉陶单极虫Protocols for diagnosis of myxosporidiosis-Part 4:Disease caused by Thelohanellus kitauei 2017-06-12发布2017-10-01实施中华人民共和国农业部发布SC/T 7223.4-2017 目U昌SCj T 7223(黠抱子虫病诊断规程拟分为如下部分:一一第1部分:洪湖腆泡虫;一一第2部分:吴李腆泡虫;一一第3部分:武汉单极虫;一一第4部分:吉陶单极虫。本部分为

2、SCjT7223的第4部分。本部分按照GBjT1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部渔业渔政管理局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(SACjTC156)归口。本部分起草单位:中国科学院水生生物研究所。本部分主要起草人:李文祥、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明。I 范围黯抱子虫病诊断规程第4部分:吉陶单极虫本部分给出了鲤CCyprinuscar:lus kitauei)的采集、固定与本部分适用于鲤吉陶2 下列文件对件。凡是不注日GB/T 66 SC/T 71 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 上游

3、引下游引本对引3.6 DNA 3.7 其他试剂见4 仪器和设备4.1 解剖盘、剪刀、慑子、4.2 体视显微镜和带测微标4.3 盖玻片、载玻片和培养皿。4.4 电子天平。4.5 普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6 普通冰箱。4.7 微量移液器。4.8 PCR扩增仪。4.9 离心管和PCR管。4.10 紫外透射仪或凝胶成像系统。4.11 水平电泳系统。SC/T 7223.4-2017，规定了吉陶单极虫CThelohanel吉陶单极虫病的综合判定。l SC/T 7223.4-2017 5 感染对象与临床症状5.1 感染对象吉陶单极虫感染鲤。5.2 临床症状吉陶单极虫寄生于鲤的肠道内，病鱼在池边独

4、游，行动迟缓，不摄食，鱼体发黑消瘦;腹部稍隆起，肠道呈结节型膨大，形成瘤状;肠壁变薄，有腹水。6 吉陶单极虫的采集、固定与标本制作6.1 病鱼采集观察待检鱼的临床症状和行为，采集具有典型症状的鱼，采样方法、样品数量、样品封存和运输应符合SC/T7103的规定。6.2 样品的采集剖开腹部，剪开肠道的膨大处，用慑子取出包囊，置于培养皿中。6.3 样品的固定用10%中性福尔马林溶液(见A.l)固定蒙古抱子虫包囊团或抱子，或用100%乙醇保存。6.4 样晶的标本制作将蒙古抱子虫样品置于载玻片上，在标本中加一滴水，或者滴加少许吉姆萨溶液(见A.2)，盖上盖玻片，用于显微镜观察。7 吉陶单极虫的鉴定7.1

5、 吉陶单极虫形态学鉴定根据显微镜内的测微标尺测量抱子和极囊的大小，吉陶单极虫抱子的形态特征见附录B。成熟抱子壳面观为长梨形，前端尖窄，近似圆锥体，后端钝圆，抱子外部具透明薄膜黯;抱子长23.0 m28.0 m，宽7.9ml1.0 m，厚8.3m10.6m;极囊1个，形状与抱子相似，长度约为抱子长的3/5，极囊长13.0m18.0 m，宽6.0m8.5m;薄膜黯长30.0m38.0 m，宽12.0m17.0 m;极丝盘成8圈10圈。如果抱子的形态特征与上述描述相符，则可判定为疑似吉陶单极虫。7.2 吉陶单极虫分子检测7.2.1 虫体DNA的提取将用100%乙醇固定的抱子(有包囊的用清水冲洗，去除

6、表面组织)充分干燥去除乙醇，置于1.5 mL 的离心管中，加人0.5mL裂解缓冲液(见A.6),55 oc下过夜。冷却至室温后，加人500LDNA抽提缓冲液(见A.7)，摇匀，5200 g离心10min，收集上清液。然后加入O.1倍体积的乙酸铀缓冲液(见A.3)和2倍上清液体积的200C预冷无水乙醇，40C下10000g离心10min弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清液，空气干燥后溶于40LTE缓冲液(见A.的中，一200C保存备用。7.2.2 18S rDNA的PCR扩增在50L的PCR反应体系中，包含模板基因组DNA10 ng50 ng、1.5 U Taq酶、1.5 mmol/L的

7、MgClz、0.2mmol/L的dNTPs、上游引物和下游引物各2mol/L、Taq酶缓冲液5L。元加热盖的PCR仪应滴加少许矿物油。在PCR扩增仪中，950C预变性5min，再950C50 s560C 50 s720C 1 min，共35个循环;最后720C延伸10min。PCR扩增时，应设置阴性对照(无虫体DNA模板和阳性对照(含吉陶单极虫DNA模板)。2 SC/T 7223.4-2017 7.2.3 PCR产物电泳与测序取5LPCR产物，加人1L澳酣蓝指示剂溶液(见A.10)，混匀，用1.0%琼脂糖凝胶(含0.05L/mL GoldView核酸染料)于TAE缓冲溶液(见A.的中电泳分离，

8、同时设置DNA分子量标准作参照，紫外透射仪下检查是否存在大约1600bp的目的条带。如存在目的条带，则取PCR扩增产物测序，其序列见附录C。7.2.4 结果判定将所测定的18SrDNA序列与附录C中的序列进行比对分析，如果相似性在99.0%及以上者，则判定为吉陶单极虫。8 综合判定8.1 吉陶单极虫的判定如果薪抱子虫的形态鉴定符合7.1的规定，且分子鉴定符合7.2.4的规定，则判定为吉陶单极虫。8.2 吉陶单极虫病的判定鲤肠道感染的虫体为吉陶单极虫，且病鱼临床症状符合5.2描述，则诊断为吉陶单极虫病。3 SC/T 7223.4-2017 A.1 10%中性福尔马林溶液10mL甲醒溶液，加90A

9、.2 吉姆萨(Giemsa)100 mL。将1水定容至1将10g 保存。A.7 DNA抽提缓冲将Tris-HCl溶液饱保存。A.8 Taq酶缓冲液(10倍PCRbuffer)附录A(规范性附录)试剂及其配制。菌去离子00 mL，室温0.5 mol/L pH 8.8的Tris-HCl、0.5mol/L的氯化饵(KCl)和1%的TritonX-100的混合溶液。A.9 TAE电泳缓冲液(50倍)将242.0g Tris碱、37.2g NazEDTA 2HzO混合，然后加人800mL的去离子水充分搅拌溶解，再加入57.1mL的冰乙酸，充分混匀，加去离子水定容至1L，室温保存。1)本附录所有试剂，除特

10、别注明外，均采用分析纯的试剂。4 SC/T 7223.4-2017 A.10 澳酣蓝指示荆溶液取澳酣蓝100mg，1JO双蒸J.K5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取煎糖25g，加双蒸水溶解后移人澳盼蓝溶液中，摇匀后加双蒸水定容至50mL，加人氢氧化铀(NaOH)溶液1滴，调至蓝色。5 SC/T 7223.4-2017 附录B(规范性附录)吉陶单极虫抱子的形态特征吉陶单极虫抱子的形态特征见图B.L8 6 10m 说明:1一一抱子长(23.0m28.0m);5 极囊宽(6.0n8.5n);2一一抱子宽(7.9mll.Om);6一一薄膜稍长(30.0m38.0m);3一一袍子厚(8.3mlO.6时

11、7一一薄膜辅宽02.0m17.0m);4一一极囊长03.0m18.0m);8 极丝(8圈10圈。图B.1吉陶单极虫抱子的形态特征6 SC/T 7223.4-2017 附录C(规范性附录)吉陶单极虫18SrDNA扩增产物的参考序列(GenBank登录号:GQ396677)1 GACTCGAGCT AATACGTGCA GTTCATTGGC TCGTCTTCGG ACGAGTCAAA GCATTTATTA 61 GACTAAACCA TCTACTATGC TCGCATAGTA AGGGGAATCT AGATAACTTT GCTGATCGTA 121 TGGCCTAGTG CCGGCGACGT T1

12、、CAATTGAGTTTCTGCCCT ATCAACTTGT TGGTAAGGTA 181 TTGGCTTACC AAGGTTGCAA CGGGTAACGG GGAATCAGGG TTCGATTCCG GAGAGGGAGC 241 CTGAGAAACG GCTACCACAT CCAAGGAAGG CAACAGGCGC GCAAATTACC CAATCTAGAC 301 AGTAGGAGGT GGTGAAGAGA ATTACTAGGT GGTGACTCAA TGAGTTACCA GTTTGGAATG 361 AACGTAACTT AAGAAATTCG ATGAGAAACA ACTGGAGGGC

13、AAGTCCTGGT GCCAGCAGCC 421 GCGGTAATTC CAGCTCCAGT AGTTTGCTTT AAAGTTGTTG CGTTAAAAC GCTCGTAGTT 481 GGATCACGCA GCAGTGCCCA GTAATCTACT ATTCGACGTA TCACTGAAAA CCACTTGTGT 541 GGCCTTTCAT GAGCTGTCAT TAGCAGATAC CAACGCTGAG CACTGTTAGT TGCACGTGAG 601 ATGAATTGTT GGCCTTTATT GAGCCGGTAT TCTCGTCTTG CGGAGTGTGC CTTGAATAAA

14、 661 ACAGAGTGCT TAAAGCAGGT CGTTGCCTGA ATGTTATAGC ATGGAACGAA CAATCGTGTA 721 TATGTGTGTA TCCTAGATTG GTGACGAGCC TTAGGCTTGT TGTTGATCTG GATGCATACG 781 GCACCCACCT AAATATGGCT GTTGGTTCCA TATACGGTGA TGATTAAAAG GAGCGGTTGG 841 GGGCATCGGT ATTTGGCCGC GAGAGGTGAA ATTCTTAGAC CGGCCAAGGA CTAACAAATG 901 CAAAGGCACT TGTC

15、TAGACC GTTTCCATTA ATCAAGAACG AAAGTGGGAG GTTCGAAGAC 961 GATCAGATAC CGTCCTAGTT CCCACCGTAA ACTATGCCGA CCTGGGATCA GTTTAGAGAT 1 021 GTTACAAGCT CTAGATTGGT CCCCCTGGGA AACCTCAAGT TTTTCGGTTA CGGGGAGAGT 1 081 ATGGTCGCAA GGCTGAAACT TAAAGGAATT GACGGAAGGG CACCACCAGG GGTGGAGCCT 1 141 GCGGCTTAAT TTGACTCAAC ACGGGGA

16、AAC TTACCTGGTC CGGACATCGA TAGGATTAAC 1 201 AGATCAATAG CTCTTTTATG ATGCGATGAG TGGTGGTGCA TGGCCGTTCT TAGTTCGTGG 1 261 AGTGATCTGT CGGCCTAATC GCGGTAACGA ACGAGACCAT AATCTCCATT TAAGAGATAG 1 321 AAGCAGACGT CTGTGCGAGT GGAGTCGCAA GATTTCACCC GTCGGGTGTT GCAGGTTGCA 1 381 TTGTGCGTCG CATTGTCAAA GTGTAGGGGC AACCTGAA

17、AC TTTGGTGGTG TGGTGTGCTT 1 441 TGTTCCC门CTATTGAGCAG CAATCGGTCT CGACTGGTTG TTGCCTTATG GAGAGACAAC 1 501 GAGGTATATA CAAGCTCGAG GAAGAGTGGC TATAACAGGT CAGTGATGCC CTTCGATGCT 1506 C 7 中华人民共和国水产f黠抱子虫t.J!程第4部分:吉陶单极虫SC/T 7223.4-2017*9导长中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址www.ccap.co皿cn)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销 9导*开本880mmX1230mm1/16 印张O.75 字数15千字2017年9月第1版2017年9月北京第1次印刷书号16109 4231 定价18.00元版权专有侵权必究举报电话(010)65005894