NY∕T 563-2016 禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术(农业).pdf

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1、ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 563一2016代替NY/T563-2002 禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术Diagnostic techniques for fowl cholera(avian pasteurellosis)2016-10-26发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 563-2016 前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替NY/T563一2002(禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术。与NY/T 563-2002相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下:一范围部分增述了多杀性巳氏杆菌PCR检测

2、方法和英膜多重PCR鉴定方法的适用性(见1);一一病原分离部分增加了多杀性巴氏杆菌生长的脑心浸出液琼脂培养基和脑心浸出液肉汤培养基(见6.1);一一一增加了多杀性巴氏杆菌PCR检测方法(见6.2);一一增加了用于多杀性巴氏杆菌英膜型鉴定的多重PCR检测方法(见6.3)。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAT/TC181)归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人:曲连东、郭东春、刘家森、姜毒、刘培欣。本标准的历次版本发布情况为:一一-NY/T 563-20020 I NY/T 563一2016禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术范围本标准规

3、定了禽霍乱的临床诊断和实验室诊断(病原分离鉴定、琼脂扩散试验、PCR检测方法和英膜多重PCR检测方法)的技术要求。本标准所规定的临床诊断、2温EE孟禽霍乱的诊断;多杀性巴氏杆菌PCR适用于多杀性巴氏杆菌种咱组!暨甲骨古啸圃-圄芙膜血清型的鉴定。2 下列文件件。凡是不注GB/T 47 3 GB/T Y/T 下列3.1 4 禽霍又名4.1 症状4.1.1 急性急性感染吸困难，临死前出4.1.2 慢性型症状f.-nllQ/，二-急性型耐过或由弱毒监感染业明-呈慢咽B贾特征主惑染，在关节、趾垫、膛黯、胸骨蒙古液囊、眼结膜、肉垂、咽晴-孟囊、骨髓、自膜等部和呈现主眈服性渗出、坏死或不同程度的纤维化。4.

4、2 病理变化急性型的病变主要是淤血、出血，肝、脾肿大和局灶性坏死，肺炎、腹腔和心包液增多。慢性型主要是局灶性化服性渗出、坏死和纤维化。5 血清学检测方法:琼脂扩散试验(该方法不适用于水禽)5.1 试剂材料5.1.1 禽霍乱琼脂扩散抗原、标准阳性血清和标准阴性血清按说明书使用。5.1.2 溶液配制1 NYj T 563一20161%硫柳隶溶液、pH6.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲(PBS)溶液和生理盐水，配制方法见A.1、A.2和A.3。5.1.3 琼脂板制备方法见B.4。5.2 操作方法5.2.1 打孔在制备的琼脂板上，用直径4mm的打孔器按六角形图案打孔或用梅花形打孔器打孔。中心孔与外周

5、孔之间的距离为3mm。将孔中的琼脂挑出，勿伤边缘，避免琼脂层脱离平皿底部。5.2.2 封底用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂微熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。5.2.3 加样灭菌生理盐水(A.3)稀释抗原，用微量移液器将稀释的抗原加入到中间孔，标准阳性血清分别加人外周的1孔、4孔中，标准阴性血清(每批样品仅做一次)和待检血清按顺序分别加人外周的2孔、3孔、5孔、6孔中。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。5.2.4 感作加样完毕后，静止5min 10 min，将平JJIl轻轻倒置，放入温盒内，置于3 7C温箱中作用，分别在24h 和48h观察结果。5.3 结果判定5.3.1 实验成立条

6、件将琼脂板置于日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，标准阴性血清与抗原孔之间不出现沉淀线，则试验成立。5.3.2 结果判定符合5.3.1的条件。a)若被检血清孔与中心孔之间出现清晰沉淀线，并与标准阳性血清孔与中心孔之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性;b)若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，但标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线一端在被检血清孔处向中心孔方向弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性，应重复试验，如仍为可疑则判为阳性;c)若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线指向被检血清孔，则被检血清判为阴性;d)若被检血清孔与中

7、心孔之间出现的沉淀线粗而混浊和标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线交叉并直伸，待检血清孔为非特异性反应，应重复试验，若仍出现非特异性反应则判为阴性;e)出现上述a)或b)的阳性结果，可判定禽体内存在禽霍乱抗体。6 病原学检测及鉴定方法6.1 病原分离鉴定方法6.1.1 样品采集按照NYjT541的要求采集并保存样品:最急性和急性病例，可采集濒死或死亡禽只的肝、脾、心血汁曼性病例，一般采集局部病灶组织;活禽，通过鼻孔挤出黠液或将棉拭子插入鼻裂中采样。对不新鲜或已被污染的样品，可采集骨髓样。6.1.2 镜检样品的制备取病变组织肝或脾的新鲜切面，在载玻片上压片或涂抹成薄层;用灭菌剪刀剪开心脏，取血液进

8、行2 NY/T 563-2016 推片，或取凝血块新鲜切面在载玻片上压片或涂抹成薄层;培养纯化的细菌，从菌落挑取少量涂片。6.1.3 培养基制备培养基和试剂质量应满足GB/T 4789.28的要求，按附录B方法配制5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂(B.l)、鲜血琼脂培养基(B.2)、5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基(B.3)。6.1.4 细菌培养将病料接种于5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼脂培养基或5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基，在350C370C温箱中培养18h24 h，观察。6.1.5 病原鉴定6.1.5.1 培养特性多杀性巴氏杆菌为兼性厌氧菌，最适生长温度为350C3rc，经18h24 h培养后，

9、菌落直径为lmm3mm，呈散在的圆形凸起，露珠样，有英膜菌落稍大。6.1.5.2 显微镜鉴定a)样品的干燥和固定:挑取菌落，涂于载玻片，采用甲醇固定或火焰固定;b)染色及镜检:甲醇固定的镜检样品进行瑞氏或美蓝染色，镜检时多杀性巴氏杆菌呈两极浓染的菌体，常有英膜。火焰固定的镜检样品进行革兰氏染色，镜检时多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，菌体大小为(0.20.4m)p.mX(0.62.5m)p.m，单个或成对存在。6.1.5.3 生化鉴定特性a)接种于葡萄糖、萧糖、果糖、半乳糖和甘露醇发酵管产酸而不产气，接种于鼠李糖、戊醒糖、纤维二糖、棉子糖、菊糖、赤薛糖、戊五醇、M-肌醇、水杨音发酵管不

10、发酵;b)接种于蛋白陈水培养基中，可产生呵|味;c)鲜血液琼脂上不产生溶血;d)麦康凯琼脂上不生长;e)产生过氧化氢酶、氧化酶，但不能产生尿素酶、自-半乳糖昔酶;D 维培(VP)试验为阴性。6.1.5.4 动物接种试验细菌纯培养物计数稀释后，以1000CFU细菌经皮下或腹腔内接种小鼠、兔或易感鸡，接种动物在24 h48 h内死亡，并可从肝脏、心血中分离到多杀性巴氏杆菌。6.1.6 结果判定符合6.1.5.1,6.1.5.2,6.1.5.3和6.1.5.4的鉴定特征，可确认分离的病原为多杀性巴氏杆菌。6.2 多杀性巴氏杆菌PCR检测方法6.2.1 主要试剂6.2.1.1 试剂的一般要求除特别说明

11、以外，本方法中所用试剂均为分析纯级;水为符合GB/T6682要求的灭菌双蒸水或超纯水。6.2.1.2 电泳缓冲液(TAE)50XTAE储存液和1XTAE使用液，配置方法见A.5。6.2.1.3 1.5%琼脂糖凝胶将1.5g琼脂糖干粉加到100mL TAE使用液中，沸水浴或微波炉加热至琼脂糖熔化。待凝胶稍冷却后加入漠化乙链替代物，终浓度为O.5g/mL 6.2.1.4 PCR配套试剂DNA提取试剂盒、10X PCR Buffer、dNTPs、Taq酶、DL2000 DNA Marker。3 NY/T 563-2016 6.2.1.5 PCR引物根据kmtI基因序列设计、商业合成，引物KMTIT7

12、、KMT1 SP6序列见附录C。6.2.1.6 阳性对照(模板DNA)菌数达到108CFU/mL以上的液体培养基繁殖的多杀性巴氏杆菌C48-1株制备的DNA。6.2.1.7 阴性对照灭菌纯水。6.2.2 样品处理6.2.2.1 组织样品的处理取约0.5g的待检组织样品于次，3000r/min离心5min，保存，应不超过24h。若需6.2.2.2 纯化培养的对分离鉴定和送检。6.2.3 基因组按照DNA照的基因组DN6.2.4 反应体6.2.4.1对6.10X 引物引物模板Taq 纯水总体积菌生理盐水混匀，反复冻融3样本在20C80C条件下6.2.4.2 样品反应管-医地.WIIP.噩噩仪E-叫

13、-售量曙四OC30 5,550C 30 5,720C 605，30个循环;6.2.5 凝胶电泳6.2.5.1在1XTAE缓冲液明电岖，问咱也.2自惘醉物i拙.0DNA Marker分别加人1.5%琼脂糖凝胶孔中，每孔加扩6.2.5.2 80V100V电压电泳30min,6.2.6 结果分析与判定6.2.6.1 实验成立条件阳性对照样品扩增出460bp片段，且阴性对照没有扩增出任何条带。6.2.6.2 结果判定符合6.2.6.1的条件，待检样品扩增出的DNA片段为460bp，可判定待检样品为阳性.否则待检样品判为阴性。6.3 英膜多重PCR检测方法6.3.1 主要试剂NY/T 563-2016

14、6.3.1.1 通用试剂6.2.1.16.2.1.4的试剂适用于本方法。6.3.1.2 阳性对照已鉴定的A型、B型、D型、E型和F型英膜型多杀性巴氏杆菌或含有多杀性巴氏杆菌型特异性基因的质粒。6.3.1.3 阴性对照灭菌纯水。6.3.1.4 引物多杀性巴氏杆菌英膜分同的基因设计引物，商6.3.2 基因组DN细菌基因组6.3.3.1 6.3.3.2 A型、B型、D片段，且阴性对照不6.3.5.2 结果判定4 符合6.3.5.1的条件.根据电码A型、B型、D型、E型和F型不5 min;94.C 30 o bp、657bp、511bp、851bp 目的条带为1044bp，英膜B型引物扩增的目的条带为

15、760bp，英膜D型引物扩增的目的条带为657坤，英膜E型引物扩增的目的条带为511bp，英膜F型引物扩增的目的条带为851bp。7 诊断结果判定7.1 临床符合第4章的症状且6.1方法检测为阳性，或临床符合第4章的症状且6.2方法检测结果为阳性，可确诊为禽霍乱。7.2 根据第5章的方法检测结果为阳性，可判定存在禽霍乱抗体。7.3 根据6.3.5.2的判定结果，可鉴定禽多杀性巴氏杆菌的英膜型。3 NY/T 563-2016 A.1 1%硫柳柔溶液的配制硫柳隶蒸悔水溶解后，存放备用附录A(规范性附录)溶液配制0.1 g 100 mL A.2 pH 6.4的0.01mol/L PBS溶液的配制甲液

16、:磷酸氢二铀(Na2HP04 12H20)加蒸馆水至乙液:磷酸二氢饵(KH2P04)加蒸馆水至充分溶解后分别保存。3.58 g 1 000 mL 1.36 g 1000 mL 用时取甲液24mL、乙液76mL混合，即为100mL pH6.4的O.01 mol/L PBS溶液。A.3 生理盐水的配制氯化铀(NaCl)蒸馆水溶解后，置于中性瓶中灭菌后存放备用。A.4 琼脂板的制备8.5 g 1 000 mL 取pH6.4的0.01mol/L PBS溶液100mL放于三角瓶中，加人O.8 g1.0 g琼脂糖、8g氯化锅。三角瓶在水浴中煮沸，使琼脂糖等充分熔化，再加1%硫柳隶溶液1mL，冷却至450C

17、50oC时，取18 mL20 mL倾注于洁净灭菌的直径为90mm的平皿中。加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发。放20C80C冰箱中保存备用(时间不超过2周)。A.5 电泳缓冲液(TAE)50XTAE储存液:分别量取Na2EDTA.2H20 37.2 g、冰醋酸57.1mL、Tris.Base 242 g，用一定量(约800mL)的灭菌双蒸水溶解。充分棍匀后，加灭菌双蒸水补齐至1000mL。1XTAE缓冲液:取10mL储存液，加490mL蒸馆水即可。6 B.1 5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂培养基制备附录B(规范性附录)培养基的配制营养琼脂85 mL 3%淀粉洛液10 mL 葡萄糖10 g 鸡血清5

18、mL NY/T 563-2016 将灭菌的营养琼脂加热熔化，使冷却到50.C，加入灭菌的淀粉溶液、葡萄糖及鸡血清，混匀后，倾注平板。B.2 鲜血琼脂培养基制备肉浸液肉汤蛋白陈85 mL 10 g 磷酸氢二押(K2HPO，)1.0g 氯化饷(NaC)5 g 琼脂25 g 灭菌加热溶化，使冷却到50.C，加入无菌鸡鲜血达10%，氓匀后，倾注平板。B.3 5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基制备脑心浸出液37 g 琼脂15 g 加蒸馆水至1000 mL 灭菌加热溶化，使冷却到50.C，加入无菌鸡鲜血达5%，棍匀后，倾注平板。7 NY/T 563-2016 附录C(规范性附录)多杀性巴氏杆菌kmt1基因PC

19、R引物序列检测目的扩增大小.bp多杀性巴氏杆菌定种460 8 NYjT 563一2016附录D(规范性附录)多杀性巴氏杆菌英膜多重PCR引物序列英膜多重PCR扩增引物序列见表D.l。表D.l英膜多重PCR扩增引物序列检测目的引物序列日-3)扩增大小，bp英膜A型上游引物:TGC CAA AA T CGC AGT CAG 1 044 英膜A型下游引物.丁TGCCA TCA TTG TCA GTG 英膜B型上游引物:CATfA丁CCAAG CTC CAC C 760 英膜B型下游引物:GCCCGAGAGIT CAA TCC 芙膜定型英膜D型上游引物:TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC 657 英膜D型下游引物:CATCTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG 英膜E型上游引物:TCCGCAGAAAATTATTGACTC英膜E型下游引物:GCTTGCTGCTTGATfTTGTC 511 英膜F型上游引物:AATCGGAGAACGCAGAAATCAG851 英膜F型下游引物:TTCCGCCGTCAATTACTCTG9