SN∕T 3091-2012 梅迪-维斯纳病检疫规程(出入境检验检疫).pdf

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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 梅迪 维斯纳病检疫规程犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉犿 犪 犲 犱 犻 狏 犻 狊 狀 犪犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国新疆出入境检验检疫局。本标准参与起草单位：中华人民共和国广州出入境检验检疫局、新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所。本标准主要起草人：段晓东、王大孝、徐军、王云飞、符子华、季新城、彭定希、艾力艾山、刘蓉芳。犛

2、 犖犜 梅迪 维斯纳病检疫规程范围本标准规定了绵羊梅迪 维斯纳病的检疫方法。本标准适用于绵羊梅迪 维斯纳病的检疫。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。绵羊进行性肺炎抗体检测方法琼脂免疫扩散试验缩略语下列缩略语适用本文件。犇犕犈犕犇 狌 犾 犫 犲 犮 犮 狅狊犿 犻 狀 犻 犿 狌 犿犲 狊 狊 犲 狀 狋 犻 犪 犾犿 犲 犱 犻 狌 犿达尔伯克氏必须基础培养基 犕犞 犇犿 犪 犲 犱 犻 狏 犻 狊 狀 犪犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲梅迪 维斯纳病 犕犞 犞犿

3、 犪 犲 犱 犻 狏 犻 狊 狀 犪狏 犻 狉 狌 狊梅迪 维斯纳病毒 犗 犉 犔狅 狏 犻 狀 犲 犳 犲 狋 犪 犾 犾 犪 犿 犫 犾 狌 狀 犵犮 犲 犾 犾绵羊胎肺细胞临床诊断与病理检查 临床诊断梅迪病：临床症状多见于岁成年绵羊。潜伏期较长。病羊消瘦，发生进行性肺部损害、呼吸困难，每分钟的呼吸次数在活动时达 次。听诊时在肺的背侧可听到罗音，叩诊时在肺的腹侧发现实音。体温一般正常。血常规检查，发现轻度的低血红素性贫血，持续性白细胞增多症。母羊发生流产或产弱羔。维斯纳病：临床症状多见于岁以上的病羊。潜伏期较梅迪病短。病羊经常落群，后肢易失足、发软，休息时经常用跖骨着地，四肢麻痹并逐渐发展

4、，行走困难，后肢步态不稳，不明原因跌倒，头姿异常，有时口唇和眼睑震颤。犛 犖犜 病理检查 病理剖检病羊肺体积肿大倍，充满整个胸腔，重量增加，呈淡灰色或暗红色，组织致密，质地变实，以膈叶变化最明显，心叶和尖叶次之。在肺胸膜下散在许多针尖大小、半透明、暗灰色小点。小结节突出于肺表面，间质增宽，切面干燥。支气管淋巴结和纵膈淋巴结肿大，切面均质发白。脑膜充血，在白质切面上有灰黄色小斑。组织学检查取病羊的肺、淋巴结、乳腺、关节、脑等组织，用 福尔马林固定，常规石蜡切片，染色后进行病理组织学检查，组织学变化见下：肺：呈慢性、间质性肺炎，以肺泡间隔增厚及淋巴滤泡性增生为特征。肺泡间隔增厚，在血管周围，眼观肺

5、胸膜下所见小点或小结节。微小的细支气管上皮组织增生，管腔内有坏死崩解的嗜中性白细胞，在炎区内肺泡体积缩小或消失。淋巴结：支气管淋巴结和纵膈淋巴结内淋巴滤泡增生、增大，呈慢性增生性淋巴结炎，淋巴细胞和网状细胞显著增生，淋巴小结肿大，有明显的生发中心。脑：呈灶性、脱髓鞘性、脑脊髓白质炎，脑白质局灶性脱髓鞘，形成脱髓鞘腔（空斑），白质中有淋巴细胞性管套，脊髓和脑膜发生非化脓性脑脊髓膜炎，脑膜增厚。乳腺：呈淋巴细胞浆细胞性乳腺炎，乳腺小叶间质中有淋巴细胞、浆细胞浸润，在导管周围形成淋巴滤泡灶。关节：表现为关节囊、滑膜囊、滑液囊增生和关节软骨及骨头的变性退化。梅迪维斯纳病毒的分离及鉴定 仪器与材料 设备

6、与器材 培养箱、超净工作台、倒置生物显微镜。标准毒株与试剂本试验所用化学试剂除另有特殊规定外，均为分析纯。标准毒株（由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局认可的单位提供）、高糖、谷氨酰胺。溶液配制参见附录。指示细胞 可在多种来源于绵羊的细胞中生长，但多以绵羊胎肺（）细胞或绵羊脉络丛（）细胞最为常用。指示细胞可自行制备，或由权威机构提供。本标准选用从未感染该病的健康绵羊获得的脉络丛（）细胞，经培养代后作为指示细胞。指示细胞在传代 代之前均可用于共培养。指示细胞的制备参见附录。操作步骤 病料的采集参见附录。犛 犖犜 白细胞的制备 将保存的抗凝血 离心 ，弃去上清液。用与原采血量等体积的 溶液将沉

7、淀重新悬浮。离心 。弃去上清液，加倍体积的 （）溶液，溶解红细胞。离心 ，弃去上清液，加含有双抗和 胎牛血清的 培养液悬浮白细胞沉淀，制成白细胞悬液。白细胞与指示细胞的共培养将白细胞悬液 ，接种于培养至融合或亚融合状态的单层指示细胞（接入被检材料的量应不大于维持液量的）。吸附 后加入 维持液（胎牛血清，双抗，）以 间隔盲传，盲传代后观察细胞。组织病料与指示细胞的共培养无菌采集的乳腺（或脾和肺）组织，加入培养液匀浆研磨，制成悬液，离心 。取上清液，按 的比例接种于单层指示细胞，吸附、培养、盲传方法同 。结果判定 阳性对照指示细胞周后出现特征性细胞病变，形成能折光的星芒状合胞体。阳性结果若被检样品

8、与指示细胞共培养出现特征性细胞病变，形成能折光的星芒状合胞体，判为 阳性。阳性结果需经过其他方法加以确认。通常采用免疫标记技术，如采用间接免疫荧光抗体技术或间接免疫酶标技术，确定病毒抗原是否存在。也可离心收集疑似的单层细胞，置于电镜下观察是否有病毒颗粒存在。阴性结果被检样品与指示细胞共培养盲传代后没有出现特征性细胞病变，可判为阴性。可疑结果被检样品与指示细胞共培养出现非特征性细胞病变，判为可疑。可疑结果需再重复一次共培养试验，或采用其他方法进行确认。琼脂免疫扩散试验按照 的规定执行。间接犈 犔 犐 犛 犃 仪器设备酶标仪、孔酶标板、微量振荡器、单通道微量可调加样器、多通道犛 犖犜 微量可调加样

9、器。试剂 抗原、阳性血清和阴性血清（由质检总局指定实验室提供并按操作说明书进行稀释使用）、酶标抗体（辣根过氧化物酶标记的兔抗羊 ，按说明书进行稀释使用）、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液、终止液。试剂配制参见附录。操作步骤 用包被缓冲液将抗原按 稀释到工作浓度（约为 ），包被 孔酶标板，每孔加，放置过夜。甩掉抗原包被液，每孔加洗涤液 ，放置 ，甩干残留液体，拍干。用同样的方法洗板次。用封闭液以 稀释阳性对照、阴性对照、被检血清，每孔，振荡混匀，作用，如 方法洗板次，拍干。加样模式参考表。表间接犈 犔 犐 犛 犃加样排列顺序 注：空白对照；：阳性血清对照；：阴性对照；：样品号。用 （

10、）以 稀释酶标兔抗羊 ，作用，如 方法洗板次，拍干。每孔加新配制的底物溶液 ，振荡混匀，室温避光作用 。每孔加 硫酸终止液。以仅加底物和终止液的孔调零，内用酶标仪在 波长下测定各孔 值。结果判定：）当被检样品的 值 时，判为阴性；）当被检样品的 值 且值 时，判为阳性；或被检样品的 值时，也判为阳性；）当被检样品的 值 且值 时判为可疑，应重复试验，若仍为可疑，判为阳性。犛 犖犜 聚合酶链反应（犘 犆 犚）仪器设备 扩增仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、可调移液器、离心机、匀浆器、天平。材料和试剂 反应管、离心管、移液器吸头、三蒸水（灭菌 ）、琼脂糖、溴化乙锭（）、犜 犪 狇酶（）、氯化镁

11、、分子量指示物（）、乙酸电泳缓冲液（）、琼脂糖凝胶、加样缓冲液。试剂配制参见附录。引物试验中选择的引物按已发表的冰岛 毒株的核酸序列（参见附录）设计，选自 区，其序列如下：上游起始位点在 ，下游起始位点在 ，操作步骤 基因组犇 犖 犃提取（由于 犕犞 犞为反转录病毒，感染细胞后，病毒基因整合到细胞基因组）用保存的 抗凝血按常规方法提取白细胞，阳性对照可用感染 的细胞悬液；阴性对照可用健康羊血提取白细胞。用下述方法或 方法或其他 提取液提取基因组。用 水悬浮白细胞，冻融次后，离心 ，弃去上清液，加 （），轻摇混匀后，加蛋白分解酶（），使其终浓度为 。水浴振荡过夜，以裂解消化白细胞。将反应液冷却至

12、室温，加入等体积饱和酚溶液（），温和地上下颠倒混匀两相（），离心 ，用大口吸管（直径 的 头）小心吸出上层水相，移至另一离心管中，尽量不要吸出水、酚两相的交界面（主要是蛋白质）。重复步骤 。在水相中加入 酶（），轻轻混匀，保温，以除去样品中的。降至室温后，再加入等体积酚：三氯甲烷（）（），温和地上下颠倒混匀（），离心 ，用大口吸管（直径 的 头）小心吸出上层水相，移至另一离心管中。加入等体积三氯甲烷（），温和地上下颠倒混匀（），离心 ，用大口吸管（直径 的 头）小心吸出上层水相，移至另一离心管中。加入 体积乙酸钠（）（）混匀后，再加入 倍体积（的）预冷无水乙醇（），室温下轻慢摇动，即可见乳白色

13、的 絮团出现，离心 。弃去上清液，加 乙醇 ，离心 。弃去上清液，并用灭菌滤纸条轻轻吸干管壁液体，放置于超净工作台内使其自然风干，至无乙醇味为止。加入无菌去离子水 ，轻弹管底，制成基因组 溶液。犛 犖犜 扩增方法反应体系（）：缓冲液、上下游引物各、氯化镁、基因组、犜 犪 狇酶 ，用灭菌三蒸水补足。反应条件：；，个循环；保持。反应结束后样品可直接进行琼脂糖凝胶电泳，或低温保存。犘 犆 犚产物电泳分析配制 琼脂糖凝胶，将扩增后产物每孔加样，以 作分子量标准。进行电泳，后用凝胶成像分析系统观察、记录结果。结果判定以 作分子量标准比较：）阳性对照孔会出现 的明亮条带；）空白对照没有条带；）对照成立才能

14、进行判定；）若检验样品在 位置有明亮条带的，进行序列分析，与 序列相符的可判为阳性；）若无核酸带或条带的大小不在 位置上，进行一次重复试验，若仍无此条带，可判为阴性。综合分析该病是由反转录病毒科慢病毒亚科的 引起，病程表现为慢性进行性过程，前期症状不易被察觉。一般后期可通过 和 检测血清中的 抗体来判断，而通过细胞培养分离病毒耗时较长。方法可用于早期检测，且灵敏度高，因此多用于该病的最终判断和进口种羊检疫。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）细胞培养溶液配制犃 犇犕犈犕 培养液可选用商品化的粉末培养基，按生产厂商提供的资料配制并除菌。犃 胰蛋白酶液的配制 胰蛋白酶 液 称取胰蛋白酶粉末 于 液，待完

15、全溶解后经 滤器过滤除菌，小瓶分装，冷冻保存。犃 胰蛋白酶犈 犇 犜 犃工作液胰蛋白酶 四钠 液 胰蛋白酶溶液滤过除菌，小瓶分装，冷冻保存。犃 狆 犎调整液 碳酸氢钠溶液，配制时用 去离子水，滤过除菌，分装于小瓶中，冰箱保存。使用时，碳酸氢钠液要逐滴加入，并不时搅动培养液，以防 值过高。犃 犔 谷氨酰胺的配制 谷氨酰胺 （），加适量 去离子水溶解，定容至 ，滤过除菌，分装，保存。使用时每 培养基中加 谷氨酰胺溶液。犃 双抗溶液的配制青霉素 链霉素将其溶于无菌三蒸水 中。双抗溶液最终使用浓度：青霉素 ，链霉素 。犃 犎 犪 狀 犽狊液、犇 犎 犪 狀 犽狊液的配制 液 液犛 犖犜 葡萄糖 酚红

16、犃 甲液的配制取 三蒸水依次溶解下列试剂 待完全溶解后，补足三蒸水至 。犃 乙液的配制取 三蒸水依次溶解下列试剂 葡萄糖 酚红 待完全溶解后，补足三蒸水至 。犃 犎 犪 狀 犽狊平衡盐溶液的配制取上述甲液、乙液等量混合，过滤除菌，冰箱保存。犃 无犆 犪犕 犵犘 犅 犛的配制 高压灭菌 。犃 红细胞裂解液犜 狉 犻 狊 犖 犎犆 犾（狆 犎 ）的配制 调 值至，高压灭菌 。犛 犖犜 附录犅（资料性附录）指示细胞的制备与使用犅 指示细胞 可在多种来源于绵羊的组织细胞中培养生长，但多以绵羊脉络丛（）和绵羊胎肺（）细胞培养最为常用。指示细胞可自行制备，或由权威机构提供。绵羊脉络丛（）细胞可以从健康胎羊

17、制备，繁殖代后贮存于液氮中。复苏的指示细胞在传代 代之前均可用于培养。犅 绵羊脉络丛（犛 犆 犘）细胞的制备犅 取材选取约三分之一妊娠期的健康绵羊剖腹取出胚胎，开颅无菌取脑室中脉络丛放入无菌平皿中。犅 漂洗用 漂洗表面血污次，取适量组织放入青霉素瓶内。犅 剪切将组织小块置青霉素瓶一角，用眼科剪反复剪切组织块成大小，然后再用 液轻洗次，静置 ，用吸管吸去上层洗液。最后一遍尽量吸去 液。犅 消化先加入 胰蛋白酶，静置 ，然后加入 倍体积的 胰蛋白酶，水浴消化 ，小心吸去消化液，用 液漂洗次，吸去 液。犅 吹打过滤将消化好的组织移入培养瓶中，加 培养基，用破口吸管充分吹打，注意吹打动作要轻柔，以免影

18、响细胞成活率。将细胞悬液用四层无菌纱布过滤，除去未消化好的组织块。犅 分瓶根据细胞密度向细胞悬液中加适量 培养基，加 胎牛血清、谷氨酰胺、双抗，调 值至。混匀后用吸管均匀分装至细胞培养瓶中，于 培养箱中培养 后，可置于倒置显微镜下观察细胞生长状况。犅 传代待细胞长成单层，弃去培养液，然后加 胰蛋白酶 消化 ，加少量培养基充分吹打，使细胞分散，留适量细胞继续培养。一般传代后可用于接种病毒。犅 细胞冻存挑选已长成单层的细胞培养物进行消化，加上适量的生长液，离心 ，弃去上清犛 犖犜 液，加少量生长液，摇匀，使细胞分散，按 加入二甲基亚砜，分瓶封口。然后，按每小时的速度降至，迅速投入液氮中保存。犅 细

19、胞复苏再培养从液氮中取出细胞瓶立即放入 水浴中，使其在 内完全融化。无菌操作将细胞悬液移入培养瓶中，补加足量营养液，置 培养箱中培养，后换液，继续培养长至单层细胞。犛 犖犜 附录犆（资料性附录）试验样品的采集犆 病毒分离共培养试验样品采集对于疑似感染的活绵羊，无菌条件下采集外周血，从中制备白细胞。可用肝素钠、乙二胺四乙酸（）或柠檬酸盐抗凝。犆 组织细胞共培养试验样品采集无菌采集尽可能新鲜的可疑组织，如乳腺、脾、肺等组织，放入无菌器皿中。犆 间接犈 犔 犐 犛 犃试验样品采集分别对正常绵羊（试验对照）和疑似感染的绵羊，无菌条件下，采集足够量的外周血，室温使其凝固，收集上层血清，做好标记，低温冷冻

20、保存。犆 犘 犆 犚试验样品采集分别对正常绵羊（试验对照）和疑似感染 的绵羊，无菌条件下，以含有抗凝剂的采血管采集足够量的外周血（采后立即摇匀），做好标记，可直接提取基因组 或低温冷冻保存，备用。犛 犖犜 附录犇（资料性附录）犈 犔 犐 犛 犃试验试剂配制试剂的配制均以去离子无菌水（电导率小于）为溶剂，高压灭菌条件为 （）蒸汽灭菌 。犇 犘 犅 犛（犿 狅 犾犔，狆 犎）缓冲液 双蒸水加至 。犇 犿 狅 犾犔犖 犪犆 犗 犖 犪 犎 犆 犗（碳酸盐包被缓冲液）液：蒸馏水 液：蒸馏水 液与 液混合，调整 至。犇 封闭缓冲液吐温 加至 。犇 洗涤缓冲液取 吐温 加入 的溶液中。犇 底物溶液 片片双

21、蒸水 溶解后分装成 瓶，保存。过氧化脲片片双蒸水 溶解后避光保存。使用前每 溶液加 过氧化脲溶液。犛 犖犜 犇 终止液浓硫酸 双蒸水 将浓硫酸缓慢地加入水中摇匀即可。犇 犿 狅 犾犔醋酸钠醋酸钠 双蒸水 完全溶解后，高压灭菌。犇 犿 狅 犾犔犜 狉 犻 狊 犎 犆 犾 碱 双蒸水 用浓盐酸（约需 ）调 值 至 ，高压灭菌。犇 犛 犇 犛 双蒸水 加热至 助溶，加水定容至 ，室温保存。犇 犿 狅 犾犔犈 犇 犜 犃（狆 犎 ）二水乙二胺四乙酸二钠 双蒸水 在磁力搅拌器上搅拌，用氢氧化钠（约）调节 至 后，加水定容至 ，高压灭菌。犛 犖犜 附录犈（资料性附录）犘 犆 犚试验试剂配制犈 犿 狅 犾犔

22、醋酸钠称取 醋酸钠（）溶于 蒸馏水中，高压灭菌。犈 犿 狅 犾犔犜 狉 犻 狊 犎 犆 犾 碱溶于 水中，用浓盐酸（约需 ）调 值，定容至 ，高压灭菌。犈 犛 犇 犛称取 于 蒸馏水中，加热至 助溶，完全溶解后加水定容至 ，室温保存。犈 犿 狅 犾犔犈 犇 犜 犃（狆 犎 ）二水乙二胺四乙酸二钠（）于 蒸馏水中，在磁力搅拌器上搅拌，用 （约）调节 至，完全溶解后，加水定容至 ，高压灭菌。犈 犜 犈缓冲液（狆 犎 ）（）、（）于蒸馏水中，高压灭菌，室温保存。犈 犜 犈 犛细胞裂解液 （）、（）、，于蒸馏水中，高压灭菌，室温保存。犈 犚 犖 犪 狊 犲溶液（犿 犵犿 犔）将 溶于 水中，于 煮 ，

23、分装成，保存。犈 蛋白酶 犓（犿 犵犿 犔）蛋白酶 溶于 水中，分装成，保存。犛 犖犜 犈 酚氯仿饱和溶液将饱和酚与三氯甲烷等体积混合，用 （）反复提取，使混合物平衡。将此均匀混合物加入等体积的 （），置于棕色瓶内，保存。犛 犖犜 附录犉（资料性附录）冰岛 犞 犻 狊 狀 犪毒株核酸序列犛 犖犜 ORIGIN 1 gggaaaagca gagtgctttg gagagctcga aggaaagagt ctccgggcct ctcctgcctg 61 cctgaaaagc tcaataaagg agttggctga tatctgagct tgctggttat tatcgggatt 121 cgt

24、tactaat tccgtgcaac accggagcgg atctcgcagc tggcgcccaa cgtggggctc 181 gacaaagaat cagaagaaaa atgagagtta tgggaccacg gacgctgctc ctgtgaggac 241 ggcgaggaga gtaacggaca cggacaaaaa gtgaaagaaa gcttcgggga cgcctgaagt 301 aaggtaagag agacacctac tggggaagta gggaatagcc cttcagtgaa ggagaaagtg 361 ttgcttgggc acaggaggag g

25、gttcgcgac cccttagaaa gacggagggg cgcgggcgtc 421 ctcctgggcc gaggggacac aagagcaaca ctggtaagga agccgccgtg gtgaggctag 481 ctagagacat ggcgaagcaa ggctcaaagg agaaaaaggg ataccccgag ctcaaggaag 541 taattaaagc aacttgtaaa ataagggtag ggcccgggaa ggagaccttg acagaaggga 601 attgtctatg ggcattaaaa actatagact ttatatttga

26、 ggatttaaaa acagagccgt 661 ggacgattac aaaaatgtat acagtatggg atagattaaa agggctaact ccggaggaaa 721 caagcaaaag agaattcgcc tccttgcaag ctacgttggc ttgcataatg tgtagtcaaa 781 tgggcatgaa gcccgagaca gtgcaggcag caaagggaat aataagtatg aaagaaggac 841 tacacgaaaa taaggaggcc aagggggaga aggtagagca actctacccc aacttaga

27、ga 901 aacataggga agtttatcct attgtgaatt tgcaagcagg agggagaagt tggaaggcgg 961 tagagtcagt agtcttccag caactgcaaa cagtggcaat gcagcatgga cttgtgtccg 1021 aggattttga gaggcaattg gcatattatg ctactacctg gactagtaaa gatatattag 1081 aagtattggc tatgatgcct gggaatagag cacagaagga attaatacaa ggaaaattaa 1141 atgaagaagc

28、 agaaaggtgg gtaagacaaa atccacccgg gccgaatgtc ctcacggtgg 1201 atcaaataat gggagtggga caaaccaatc agcaggcatc tcaagccaat atggatcagg 1261 caagacagat atgcctgcag tgggtaataa cagcgttaag atcagtgagg catatgtcac 1321 atagaccagg aaaccctatg ttagtgaagc agaagaatac tgagagttat gaagacttca 1381 tagctcgcct actagaggct attg

29、atgcgg aaccagtgac ggaccctata aaaacatatt 1441 taaaagtaac attgtcatat acaaatgcta gcacagactg tcaaaagcag atggatagga 1501 cattggggac gagggttcaa caagcaacgg tagaagaaaa gatgcaagca tgtcgagatg 1561 tgggatccga aggatttaag atgcaattat tagcacaagc tttgagaccg caagggaagg 1621 caggacacaa aggggtaaat caaaagtgtt ataattgtg

30、g aaaaccagga catctcgcaa 1681 gacagtgtag acaaggaata atatgccatc attgtggaaa aagaggacat atgcaaaagg 1741 actgccggca gaagaaacag cagggaaaca acaggagggg gccacgtgtg gtgccgtccg 1801 cgccccctat gttgtaacag aagcaccacc caaaatagaa ataaaagtag gaacaaggtg 1861 gaaaaaatta ttagtagata cgggggcaga taaaactata gtaacatccc atg

31、atatgtc 1921 agggatacca aaggga 犛 犖犜 2401 tccaggagga ttacagagaa agaaacatgt aacaatatta gatataggag atgcatattt 2461 tacaatacca ttatatgagc catatagaca atatacatgc tttaccatgt taagtccaaa 2521 taatttagga ccatgtgtaa gatattattg gaaagtgtta ccacaaggat ggaaattaag 2581 tcctgcagtg tatcaattta caatgcaaaa aatattaaga gg

32、atggatag aagaacaccc 2641 tatgatacaa tttggaatat acatggatga tatctatata gggagtgatt taggactaga 2701 agagcacagg ggtatcgtga acgaactagc atcatatata gcgcaatatg gattcatgct 2761 gcctgaagat aagaggcaag aaggataccc ggcgaaatgg cttggatttg aattgcatcc 2821 ggagaaatgg aaatttcaaa aacatacgct cccagagatt acagaaggac ccataac

33、ctt 2881 gaataaacta cagaaattag taggagattt agtttggaga caatccctaa taggaaaaag 2941 catcccaaat atcttaaaat taatggaagg agatagggct ttacaaagtg aaagatacat 3001 agagagtata catgtaagag aatgggaagc ctgtagacaa aagctgaagg aaatggaagg 3061 aaattattat gatgaagaga aggatatcta tgggcaacta gattggggaa ataaagcaat 3121 agaatac

34、ata gtatttcaag aaaaaggaaa acctttatgg gtaaatgtag tacatagtat 3181 taagaatttg agtcaagccc aacaaattat caaagcagca caaaaactga cacaagaagt 3241 aataataaga acaggcaaga taccctggat tttgttgccg ggaagggaag aagattggat 3301 attagagtta caaatgggaa acataaattg gatgccatca ttttggtcat gttataaagg 3361 ctcggtgagg tggaaaaaga g

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