SN∕T 4151-2015 化学品 陆生寡毛类的生物蓄积试验(出入境检验检疫).pdf

《SN∕T 4151-2015 化学品 陆生寡毛类的生物蓄积试验(出入境检验检疫).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN∕T 4151-2015 化学品 陆生寡毛类的生物蓄积试验(出入境检验检疫).pdf（20页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 化学品陆生寡毛类的生物蓄积试验犆犺 犲犿 犻 犮 犪 犾 狊犜 犲 狊 狋犿犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉犫 犻 狅 犪 犮 犮 狌犿狌 犾 犪 狋 犻 狅 狀犻 狀狋 犲 狉 狉 犲 狊 狋 狉 犻 犪 犾狅 犾 犻 犵 狅 犮 犺 犪 犲 狋 犲 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准与联合国经济合作发展组织（）化学品试验导则 陆生寡毛类的生物蓄积（）（英文版）技术内容一致。本标准与化学品试验导则 相比，主要变化如下：对化学品试验导则 进行了编辑性修改：将简介改为引言；增加了前言部分；增加了范围一章

2、；将附录内容转移至术语和定义部分；调整了附录顺序；删除的参考文献部分。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：贾晓川、张园、丁宇、刘汉伟、李宁涛、赵琢、王华、刘伟、柳明、孙俐、刘凤娟。犛犖犜 引言在经合组织试验导则中，测试对环境有害化学品的生物体内富集的方法包括：年公布的流水式鱼类试验（）和 年公布的海栖寡毛类生物蓄积试验（）。但将水生生物的富集数据推断到陆生生物（例如蚯蚓）的富集情况还是困难的。目前，对土壤中化学品的生物富集评估是通过基于化合物亲脂性的模型计算方法实现的，如欧盟指导

3、性技术文件（）。此外，对陆地食物链中二次中毒的评价也特别重要，特殊隔室试验法（）可以满足这项检测评估的需求。一些利用鱼类以外其他生物的国际方法解决了生物体内的富集问题，如美国试验与材料协会（）开发的利用蚯蚓（犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪，）和锅蠕虫测试被污染土壤生物富集性的实验方法。一种国际公认的测定土壤中加标样品的生物富集试验方法，将有利于改进陆地生态系统的化学品风险评估。在直接暴露在土壤基质的噬土无脊椎动物中，陆栖寡毛类对维持土壤结构和功能方面起着重要作用。陆栖寡毛类在土壤中生存，部分分布在土壤表面（特别是枯枝落叶层），它们通常是土壤中最丰富生物量（）的代表。通过进行土壤

4、生物扰动和被其他动物捕食，这类动物对其他生物如无脊椎动物（捕食螨和甲虫）或脊椎类食肉动物（狐狸和海鸥）的生物利用度影响巨大。实验室土壤毒性和生物富集性蚯蚓（犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪）和线蚓（犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻 犱狌 狊）试验指导为当前土壤生物富集性试验方法的操作提供了许多重要和有用的细节。实践经验与土壤生物富集性研究和文献出版物也是本标准的主要信息来源。本标准方法主要适用于易吸附于土壤的稳定、中性有机化学品。本方法可能适用于土壤伴生物、稳定的金属有机化合物的生物富集试验。本方法也可应用于金属和其他微量元素。犛犖犜 化学品陆生寡毛类的生物蓄

5、积试验范围本标准规定了陆生寡毛类的生物蓄积试验的术语和定义、试验有效性、试验方法、试验操作、数据和报告。本标准适用于稳定、中性并易于土壤吸附的有机化学品的生物蓄积试验，可用于土壤伴生物、稳定的金属有机化合物，也可用于金属和其他微量元素的生物蓄积试验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。化学品蚯蚓急性霉性试验术语和定义下列术语和定义适用于本文件。生物蓄积犫 犻 狅 犪 犮 犮 狌犿狌 犾 犪 狋 犻 狅 狀试验生物体（或特定组织）内某种受试物的浓度相对于试验介质中

6、该物质浓度的增加。生物浓缩犫 犻 狅 犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀试验生物体内或体表受试物浓度的增加，相对于周围介质中的受试物浓度，是由试验生物体单一的从周围介质中吸收受试物而产生的结果（如通过体表吸收和吞咽土壤吸收）。生物放大犫 犻 狅犿犪 犵 狀 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀试验生物体内或体表受试物浓度的增加，相对于食物或其捕食物中的受试物浓度，主要是由试验生物体从被污染食物或其捕食物中吸收受试物而产生的结果。生物放大可导致受试物在食物链中的转移和蓄积。消除犲 犾 犻 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀受试物在试验生物体（或特定组织）中主动或被动的损失过程，与受试物

7、在周围介质中的存在与否无关。生物蓄积因子犫 犻 狅 犪 犮 犮 狌犿狌 犾 犪 狋 犻 狅 狀犳 犪 犮 狋 狅 狉；犅犃犉试验吸收阶段的任何时间，试验生物体（或特定组织）内某种受试物浓度（犆，试虫净重）与试验介质中该物质浓度（犆，介质净重）的比率；单位为（介质）（试虫）。稳定态生物蓄积因子狊 狋 犲 犪 犱 狔狊 狋 犪 狋 犲犫 犻 狅 犪 犮 犮 狌犿狌 犾 犪 狋 犻 狅 狀犳 犪 犮 狋 狅 狉；犅犃犉狊 狊稳定态下，试验生物体（或特定组织）内某种受试物浓度（犆，试虫净重）与试验介质中该物犛犖犜 质浓度（犆，介质净重）的比率；单位为（介质）（试虫）。动力学生物蓄积因子犽 犻 狀 犲

8、狋 犻 犮犫 犻 狅 犪 犮 犮 狌犿狌 犾 犪 狋 犻 狅 狀犳 犪 犮 狋 狅 狉；犅犃犉犓土壤吸收速率常数（犽）与消除速率常数（犽）之比（犽犽）为动力学生物蓄积因子。生物群一土壤蓄积因子犫 犻 狅 狋 犪 狊 狅 犻 犾犪 犮 犮 狌犿狌 犾 犪 狋 犻 狅 狀犳 犪 犮 狋 狅 狉；犅犃犛 犉试验生物体内或体表以脂肪为标准的受试物浓度与稳定态时土壤中以有机碳为标准的受试物浓度的比值。此时犆又表示为 生物脂肪含量，犆表示为 土壤有机碳含量；单位为（土壤有机碳）（脂肪）。平台期或稳定态狆 犾 犪 狋 犲 犪 狌狅 狉狊 狋 犲 犪 犱 狔狊 狋 犪 狋 犲在暴露期内当吸收过程和消除过程同时

9、进行时，这两个过程间的平衡期。达到稳定态的条件：不再随时间变化，取样时间至少间隔，取样次，所得值相差不超过，个采样周期无显著的统计学差异。当受试物吸收缓慢时，应延长间隔至。有机碳一水分配系数狅 狉 犵 犪 狀 犻 犮犮 犪 狉 犫 狅 狀 狑犪 狋 犲 狉狆 犪 狉 狋 犻 狋 犻 狅 狀 犻 狀 犵犮 狅 犲 犳 犳 犻 犮 犻 犲 狀 狋（犓狅 犮）物质在有机碳水两相介质中达到平衡时的浓度之比。正辛醇水分配系数狅 犮 狋 犪 狀 狅 犾 狑犪 狋 犲 狉狆 犪 狉 狋 犻 狋 犻 狅 狀 犻 狀 犵犮 狅 犲 犳 犳 犻 犮 犻 犲 狀 狋（犓狅狑）物质在正辛醇水两相介质中达到平衡时的浓度

10、之比，也表示为犘。犓的对数值（犓）被用作水栖生物对受试物的潜在生物蓄积性指征。吸收期或暴露期狌 狆 狋 犪 犽 犲狅 狉犲 狓 狆 狅 狊 狌 狉 犲狆 犺 犪 狊 犲吸收期或暴露期指试验生物暴露在受试物下的时期。土壤吸收速率常数狊 狅 犻 犾狌 狆 狋 犪 犽 犲狉 犪 狋 犲犮 狅 狀 狊 狋 犪 狀 狋（犽狊）试验生物体暴露于含有受试物质的土壤中，试验生物体内或体表受试物浓度增加速率。犽可以表示为（土壤）（试虫）。消除期犲 犾 犻 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狆 犺 犪 狊 犲试验生物从含有受试物的介质转移到不含受试物的介质中后的时期，期间研究受试物在试验生物中的消除（净损失）。消除速

11、率常数犲 犾 犻 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狉 犪 狋 犲犮 狅 狀 狊 狋 犪 狀 狋（犽犲）试验生物从含有受试物的介质转移到不含受试物的介质中后，试验生物体内或体表受试物浓度降低的速率。犽可以表示为。试验 试验原理 用来表示物质生物蓄积性的参数包括：生物蓄积因子（）、吸收速率常数（犽）和消除速率常数（犽）。犛犖犜 试验包括两个阶段：吸收（暴露）期和消除（暴露之后）期。吸收期内，多个重复组的试虫暴露在已添加受试物的土壤中，并在不含受试物的相同土壤中设置对照组。通过对照组测量试验试虫的干重和脂肪含量，并通过测定对照组试虫和土壤获得试验背景值（空白值）。消除期内，将试虫转移到不含受试物的土壤

12、中（如果吸收期内试虫对受试物的吸收量极低，可以取消消除期试验）。通过消除期试验，可获得试虫对受试物的排泄速率。如果吸收期未达到稳定态，动力学参数（、犽和犽）应通过同时拟合吸收期和消除期的结果以确定。在试验吸收期和消除期均应对试虫体内或体表受试物的浓度进行监测。在吸收期内，应持续取样测量（针对线蚓）、（针对蚯蚓）或达到稳定态。达到稳定态的判定依据：试虫中受试物浓度不再随时间变化，并对采集间隔不短于的样品（个连续浓度批次）进行分析，经统计学比较（如方差分析、回归分析）批间偏差不超过。消除期包括试虫转移至空白容器的过程，消除期内应持续取样测量（针对线蚓）或（针对蚯蚓）（如果测出试虫体内受试物量减少了

13、，可提前结束取样测量）。消除期结束时试虫体内的受试物量记作未消除残留量。生物蓄积动力学因子等于土壤中的吸收速率常数（犽）与消除速率常数（犽）的比值，将其设为一级动力学（参见附录）。如果一级动力学不适用，应使用其他动力学模型。通过计算机模型方程计算吸收速率常数、消除速率常数（或使用其他模型时涉及的常数）、生物蓄积动力学因子等参数的置信限。任何模型的拟合优度都可以通过相关系数、测定系数（系数接近时示为良好的拟合）或卡方确定。同样，标准偏差的大小或估算参数的置信区间也可以用来表示模型的拟合优度。为减小亲脂性受试物试验结果的差异性，生物蓄积因子的表示方式应与脂肪含量和有机碳含量相关（有机碳）（试虫脂肪

14、）。使用此方法的依据：对于某些类化学品，其潜在生物蓄积性与亲脂性是相关的，例如鱼类脂肪含量与某些化学品的生物蓄积性相关，海底栖息生物也具有类似的相关性。研究证明在陆栖寡毛类生物中该相关性同样适用。如果试验用试虫数量足够，应在测试组内进行脂肪含量测定。如果试虫数量不充足，可使用对照组进行脂肪含量测定。试验有效性为保证试验的有效性，对照组和测试组均须严格执行以下准则：）试验结束时，试虫在吸收期和消除期的总死亡率不应高于参试总数的（蚯蚓）和（线蚓）；）对于蚯蚓（犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪和犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犪 狀犱 狉 犲 犻），在吸收期和消除期结束时测定的平均质量损失不

15、高于各期初原始鲜重的。试验方法 试验生物种类推荐用于生物蓄积性试验的几种陆栖寡毛类动物：正蚓科犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪或犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犪 狀犱 狉 犲 犻，线蚓科犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻 犱狌 狊、犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犮 狉 狔狆 狋 犻 犮 狌 狊或犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犾 狌狓狌 狉 犻 狅 狊 狌 狊（参见附录）。仪器装置装置各部分所使用的材料均不应溶解或吸附受试物，不浸出其他物质，并对试虫无不良作用。可以使用惰性化学材料制作、适当容积的标准矩形或圆柱形容器，并依据负荷率（参试试虫数量）要求使

16、用。不锈钢、塑料或玻璃可用于任何与试验媒介有接触的装置。试验容器在保证透气的前提下，应适当遮盖以防试虫逃脱。对于强吸附性物质（如人工合成的拟除虫菊酯），应使用硅烷化的玻璃装置进行试验，用完的仪器装置应废弃。放射性标记的受试物和挥发性化学品应防止其散漏，配备具有适当吸收剂的防犛犖犜 漏装置（如玻璃洗气瓶）以防残留物从试验容器中泄露。试验土壤试验土壤应能够保证试验生物在适应期和试验期间的生存和更好的繁殖，保证其不出现异常的表现和行为，土质松软适合试虫掘洞。推荐使用 描述的人工土壤作为试验基质（参见附录）。风干的人工土壤在使用前应室温储存。从未被污染的场所取得的天然土壤可用作试验土壤和培养土壤。天然

17、土壤至少应具备以下特征信息：来源（采集地）、值、有机碳含量、粒径分布（沙子、淤泥和粘土含量）、最大持水量（）和含水百分比。使用前应对土壤或其组分的微量污染物进行分析以获取有用信息。如果土壤采自田间，则该土壤在试验前应至少年内未经农药或动物源肥料处理，且半年内未经有机肥料处理。天然土壤在实验室中的储存时间应尽量短。受试物的使用 受试物与土壤混合时，应考虑其理化性质。水溶性的受试物应在水中溶解完全再与土壤混合。对于水溶性较差的受试物，建议通过将受试物包覆于一种或多种（人工）土壤表面而实现混合。例如，先将石英砂或其一部分浸泡在受试物溶液（适当的有机溶剂溶解）中，再缓慢将溶剂蒸发干，再将表面包覆受试物

18、的石英砂与湿土混合，从而将受试物与土壤混合均匀。此方法的主要优点是未将任何溶剂带入土壤。在使用天然土壤进行试验时，用风干的天然土壤代替人工土壤进行包覆，或在有增溶剂的前提下，于随后的蒸发阶段通过搅拌将受试物混入湿土中。一般来说，应尽量避免湿土与溶剂的接触。应考虑以下因素：）如果使用水以外的其他溶剂，应选择可以与水混溶和可以去除（如通过蒸发）的，这样可以在土壤中仅留下被测化学物质；）如果使用溶剂对照，无需加入阴性对照。溶剂对照组应包含加入土壤中溶剂的最大浓度，并使用与配制储备液时同一批次的溶剂。溶剂的毒性和挥发性以及受试物在所选溶剂中的溶解性是选择溶剂的主要依据。对于在水和有机溶剂中溶解性均较差

19、的受试物，可以将细石英砂（每个试验容器）与受试物通过研磨混合（利用研钵和杵）以获得所需的试验浓度。将受试物与石英砂的混合物加入已润湿的土壤中，与适量的去离子水充分混匀以获得所需的含水量。将最终混合物分装在各个试验容器中。每个试验浓度均重复本步骤，并且每个试验容器中 细石英砂也须设置适当对照组。掺样后应对土壤中的受试物浓度进行测定。加入测试生物前应确认受试物在土壤中均匀分布。所用掺样方法和选择特殊掺样操作的原因应予以说明。加入试验生物之前应建立良好的土壤与孔隙水的平衡，建议通过 恒温来实现。许多水溶性差的有机化合物，其吸收和溶解的组分达到真正平衡的时间可能需要几天或者几个月。根据不同的研究目的，

20、在模拟环境条件时，掺样土壤需要经过不同时间的“老化”（例如金属需要周保持 的“老化”期）。试验生物的培养最好保持固定的实验室试虫培养方法。试验的试虫应无可观察到的疾病、异常和寄生虫。试验操作 总则在吸收阶段将试验生物暴露在受试物中，这一阶段应持续（针对线蚓）或（针对蚯蚓），除非犛犖犜 证明已提前达到稳定态。在消除阶段将试验生物转移到不含受试物的土壤中，第一次取样应在消除期开始后的 内进行（参见附录）。试验生物 很多陆栖线蚓的个体重量非常小（例如每只犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻 犱狌 狊线蚓体重，而犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犮 狉 狔狆 狋 犻 犮 狌 狊或犈

21、狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犾 狌狓狌 狉 犻 狅 狊 狌 狊线蚓则更小），因此应将重复组容器中的试虫集中在一起进行体重测定和化学分析（如所有重复组容器中的试虫将被用来获得同一个组织分析结果）。应至少设置个重复组，每组中 只线蚓。如果受试物的分析检测限较高，则应使用更多的试虫进行试验。如果使用个体重量较大的试虫种类（犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪和犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犪 狀犱 狉 犲 犻），每个重复组容器中可以仅用一只试虫。同一试验中应使用体重相近的蚯蚓（如犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪和犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犪 狀犱 狉 犲 犻个体重量应在

22、）。试验用线蚓（犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻 犱狌 狊）体长应大约。同一试验中的所有试虫应具有相同来源，并应是具有生殖带的成虫。试虫的体重和年龄可能对值有影响（由于脂肪含量的变化和是否产卵），应准确记录此类参数并在解释结果时加以考虑。此外，暴露期内产生的虫茧也将影响值，应存放在试验容器中。建议在试验前测定试虫的子样重量，以估计平均含水量和干重。应采用高的土壤试虫比率，以将吸收期内土壤中受试物浓度的降低减至最少。对于犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪和犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犪 狀犱 狉 犲 犻，建议每只试虫至少使用（净重）土壤；对于线蚓，建议每个试验容器中

23、土壤的最小量应为 （净重）。容器中的土壤厚度应在（线蚓）或（蚯蚓）。将试验试虫从培养容器中取出，成虫转移到未经处理的试验土壤中进行适应和饲养（见 ）。如果试验时的条件与培养时的条件不同，可以通过 的适应期以使试虫适应试验条件。适应期结束后，先将蚯蚓转移到盛有净水的玻璃培养皿（皮氏培养皿）中清洗，测定体重后再转移到试验土壤中。测定体重前，应将虫体外附着的水除去，可通过将虫体轻触培养皿边缘或用微湿的纸巾小心地将水吸干。应观察并记录试虫的掘洞行为。在使用蚯蚓的试验中，试虫（对照组和受试物处理组）通常会用几小时的时间在土壤中掘洞，应在将试虫转移到试验容器中后的 内检查其掘洞行为。如果供试蚯蚓没有在土壤

24、中掘洞（在吸收期的多半时间内，未掘洞试虫数超过），则表明试验条件不合适或试虫不健康。这时应停止并重新进行试验。线蚓主要在土壤的孔隙中生存，并且其体表通常部分的与周围基质接触，因此假设受试物对掘洞和不掘洞线蚓的暴露量是相同的，不掘洞线蚓无须重复试验。饲养当使用总有机碳含量低的土壤时应对试虫进行喂养。当使用人工土壤时，对于蚯蚓建议每周喂养量为干粪肥土壤（净重），对于线蚓建议每周喂养量为 磨碎的燕麦片土壤（净重）。应在试虫放入之前将第一次投放的食物混入土壤中。最好使用与培养时相同类型的食物。光照和温度进行试验时应控制黑白循环交替时间为，试验容器中的光照强度应在 。试验期内的温度应保持在。试验浓度应使

25、用单个浓度进行试验。使用额外浓度时应予以说明。当受试物的毒性（）接近分析方法的检测限时，建议使用放射性高的特殊放射性标记受试物。金属受试物浓度应高于试虫和土壤中的背景值。犛犖犜 重复进行动力学测定时（吸收期和消除期），应在每个取样节点设置至少个处理组。处理组的数量应能满足吸收期和消除期内的全部取样。进行生物观察和测定（例如干湿重比和脂肪含量）及试虫和土壤中背景浓度测定时，如果仅适用水作为溶剂，则应设置至少 个阴性对照组（开始试验时组、吸收期末组、消除期末组）。如果在受试物应用时使用任何增溶剂，应在处理组外加设溶剂对照组（开始试验时组、吸收期末组、消除期末组），溶剂对照组中应包含除受试物外的所有

26、组分。这种情况下，还应准备个阴性重复对照组（无溶剂），以便在吸收期的末期进行选择性取样。可通过这些重复组与溶剂对照组进行比较，以获得可能存在的溶剂对试虫影响的信息。建议为试验组和对照组准备数量充足的额外重复组容器（个）。土质测定频率应在吸收期和去除期的开始和结束时测定试验室中土壤的值、水分含量和温度（连续的）。每周应对土壤含水量进行一次控制，可以通过试验容器称重和比较容器的实际重量与试验初始时的重量实现。失去的水分应利用去离子水补充。试虫和土壤的取样分析 在放入试虫前、吸收期内和消除期内，应对试验容器中的土壤取样并测定受试物浓度。试验期间的受试物浓度应通过测定试虫和土壤来确定。通常应测定全土壤

27、中的浓度，也可以选择性的测定土壤孔隙水中的受试物浓度。通过孔隙水测定受试物浓度时，应在研究开始前提出理由和适当的方法，并在研究报告中记录。应在吸收期和消除期内的至少个时间节点对试虫和土壤进行取样。如果已证明受试物是稳定的，那么对土壤的分析次数可以减少。建议在吸收期的开始和末尾分别对至少重复组进行分析。如果土壤中受试物浓度在吸收期末的测定结果与其初始浓度相差超过，其他日期采集的土壤样品。在每次取样时将试虫从土壤中取出（例如：先将土壤铺散在浅托盘中，再用软镊子摘取出试虫），在浅玻璃（或铁质）托盘内快速冲洗试虫。去除试虫上多余的水（见 ）。将试虫转移至已称重的容器中，立即称重，包括其肠道内容物。将蚯

28、蚓（犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪）放在铺有湿润滤纸的具盖皮氏皿中过夜，让其排泄肠道内容物（见 ）。排泄后测定试虫的体重以估计试验中生物量的减少（见有效性准则）。由于线蚓体型过小，对其称重和组织分析前无须进行清肠。最终称重结束后，应通过适当的方法（例如用液氮或 以下冷冻）将试虫立刻处死。消除期间试虫用清洁的土壤替代被污染的肠道内容物，应在消除期开始前立刻对未清肠的试虫（此处指线蚓，其肠道内含污染的土壤）取样。对于水栖寡毛类，在消除期开始 后，其肠道内被污染的内含物已被清洁的沉积物替代。对于蚯蚓也有类似的研究结果，已有利用其对放射性标记的镉和锌进行生物蓄积试验的研究。未清肠的线蚓体内的消除期第一个样

29、本的浓度，在清肠后也被可认为是组织浓度。为解释在消除期内清洁土壤对受试物浓度的稀释，肠道内容物的重量可通过试虫湿重除以试虫死亡时重量或者试虫干重除以试虫死亡时重量的比值来估算。土壤和试虫样本应在转移后立刻（）分析，以防降解或其他损失，建议通过计算试验数据获得近似吸收率和消除率。如果延迟分析测定，则应用适当方法储存样品（例如在不高于 深度冷冻）。应检验化学分析的精密度和重复性，以及受试物在试虫和土壤样本中的回收率，还应报告提取效率、检测限（）和定量限（）。同样，还应确定浓度高于背景值的对照容器中不应检测出受试犛犖犜 物。当对照组试虫中受试物浓度（犆）大于零时，应将其纳入动力学参数的计算中。在整个

30、试验过程中应对样本进行管理以减少污染和损失（如受试物在取样装置上吸附引起的损失）。当使用放射性标记的受试物时，应对母体和代谢物进行分析。母体化合物和代谢物在稳定态或吸收期末的定量将提供重要信息。进而应将这类样本“纯化”以单独对母体化合物定量。如果单一化谢物的辐射强度超过分析样本中总辐射强度的，则建议对该代谢物进行鉴定。应记录和报告总回收率，及受试物在试虫、土壤和装有防止受试物挥发的吸附剂的装置（如果使用）中的回收率。对于体型小于蚯蚓的线蚓，允许将给定试验容器中的试虫个体进行混合集中。如果混合集中引起重复组数量的减少，将限制可应用于数据分析的统计程序。如果要求使用特殊的统计程序和权重，则试验应包

31、含足够多的重复组数量以适应所要求的混合集中、程序和幂。建议将即表示为一个净重的函数，也可以按要求（对于高疏水性物质）表示为一个脂肪含量的函数。应使用适当的方法测定脂肪含量，可使用三氯甲烷甲醇提取方法。然而，为了避免使用氯代溶剂，应使用改进的“”法。由于不同方法可能得到不同的数值，因此方法的细节很重要。有条件时（如可以提供足够的试虫组织），脂肪分析最好使用受试物测定时的样本或提取物，因为在进行色谱分析前必须将提取物中的脂肪去除。对照组的试虫可以代替试验组先进行脂肪含量测定，再用于值的计算。此方法可以减少受试物对试验装置的污染。数据和报告 结果处理受试物的吸收曲线通过将吸收期内试虫体内或体表的受试

32、物浓度对时间作图制得。当曲线到达平台期或稳定态时，稳定态生物蓄积因子 通过式（）计算：稳态或吸收期末犆（平均值）稳态或吸收期末犆（平均值）（）式中：犆 试验生物中的受试物浓度；犆 土壤中的受试物浓度。当试验中没有稳定态时，应使用基于速率常数的代替，并通过以下内容进行确定：）通过犽犽的比值来确定蓄积因子（）；）最好同时计算吸收率和消除率；）通常利用消除曲线（如消除期试虫体内的受试物浓度曲线）确定消除率（犽），吸收率犽通过给定的犽和源于吸收曲线的犆算得。在计算机上进行非线性参数括计法运算是获得和速率常数犽、犽的首选方法。如果消除反应不为一阶，则应采用更复杂的模型。试验报告试验报告应包括以下信息：）

33、受试物 受试物对陆生寡毛类生物已知的任何急性或慢性毒性（、）；纯度、物理性质、物理化学性质（例如 犓）、水溶性；物质鉴定数据、受试物来源、所用溶剂及其浓度；如果使用放射性标记的受试物，标记原子的精确位置、具体放射强度、放射化学物质纯度；）试验物种 学名、种属、预处理、适应方式、年龄、尺寸范围等；犛犖犜 ）试验条件 所用试验方法；所用光照灯的类型、性质和光照周期；试验设计（例如试验容器数量和大小、土壤质量和土层厚度、重复次数、每次重复的试虫数量、受试物浓度数量、吸收期和消除期的持续时间、取样频率）；试验容器材质的选择依据；受试物制备和应用方法以及特殊方法的选择原因；标称试验浓度、试验组测量平均值

34、及其标准偏差、获得数据的方法；人工土壤组分来源或土壤原产地（如使用自然媒介）、所有预处理的描述、对照组结果（存活率、生物量变化、生殖）、土壤性质值、总有机碳含量、粒径分布（沙子、淤泥和粘土百分含量）、最大持水量、试验开始和结束时的水分含量、任何其他测定；对土壤样本和试虫样本处理的详细信息，包括：制备、储存、加标方法、提取、受试物在试虫和土壤中的分析方法（精密度）、脂肪含量（如测定）和受试物回收率。）结果 对照组和每个试验组试虫的死亡率、观察到的任何其他异常行为（例如逃离土壤、线蚓生物蓄积试验时缺乏再生）；士壤和试验生物的净重与湿重比（利于标准化）；每次取样时试虫的湿重；对于蚯蚓，试验开始时和清

35、肠前后的湿重；试验生物的脂肪含量（如测定）；显示受试物在试虫中吸收和消除动力学的曲线、达到稳定态的时间；所有取样时间的犆和犆（如果合适，给出标准偏差和范围）（犆用 整个虫体的湿重和净重来表示，犆用 土壤的湿重和净重来表示）。如果要求生物群土壤蓄积因子（）（例如比较两个或多个用不同脂肪含量的动物进行的试验），犆又可以用 生物脂肪含量来表示，犆用 土壤有机碳来表示；表示为（土壤）（试虫）、土壤吸收速率常数犽表示为（土壤）（试虫）、消除速率常数犽（表示为）；表示为（土壤）（试虫脂肪）也可以加入报告中；数据统计分析方法。）结果评价 结果应遵从 中的有效性准则；意外或不寻常的结果（例如受试物在试虫中消除

36、不完全）。犛犖犜 附录犃（资料性附录）吸收期和消除期参数的计算生物蓄积因子（）是生物蓄积试验的主要结果，其数值为稳定态时生物体中受试物浓度（犆）与土壤中受试物浓度（犆）的比值，也称稳定态生物蓄积因子（）。在吸收期未达到稳定态的情况下，应使用动力学生物蓄积因子（）代替稳定态生物蓄积因子（）。因此，计算时应注意是否达到稳定态。通常利用非线性参数估算法在计算机上获得、犽和犽，利用式（）和式（）进行计算：犆犽犽犆犽狋（）狋狋（）或犆犽犽犆犽（狋狋）犽狋狋狋（）式中：犆 试虫中受试物浓度，单位为克每千克（）；犽 吸收速率常数，单位为克每千克每天（）；犆 土壤中受试物浓度，单位为克每千克（）；犽 消除速率

37、常数，单位为每天（）；狋 吸收期结束时所用时间，单位为天（）。当试验开始时（第天）对照试虫组中的背景浓度明显不为零（例如测定金属受试物时），此时背景浓度（犆，）应计算入式内，此时使用式（）和式（）：犆犆，犽犽犆（犽狋）狋狋（）或犆犆，犽犽犆犽（狋狋）犽狋狋狋（）当出现吸收阶段土壤中受试物浓度随时间变化显著减少的情况时，应使用式（）、式（）和式（）进行计算：犆犆（犽狋）（）式中：犆 土壤中受试物浓度，单位为克每千克（）；犽 受试物在土壤中降解速率常数，单位为每天（）；犆 土壤中受试物的初始浓度，单位为克每千克（）。犆犽犽犽 犽狋犽狋（）狋狋（）犆犽犽犽 犽狋犽狋（）犽（狋狋）狋狋（）式中：犆 试

38、虫中受试物浓度，单位为克每千克（）；犽 吸收速率常数，单位为克每千克每天（）；犽 受试物在土壤中降解速率常数，单位为每天（）；犽 消除速率常数，单位为每天（）；狋 吸收期结束时所用时间，单位为天（）。犛犖犜 当在吸收期内达到稳定态时（例如：狋），（）可以简化为式（）：犆犽犽犆或犆犆犽犽（）稳定态时受试物在试虫中的浓度（犆，）可用犽犽犆表示。可通过式（）计算：犳 犳 （）式中犳 为土壤有机碳分数，犳 为试虫脂肪分数，两者均取决于试验样品，干重与湿重均可。消除阶段动力学可以通过消除期的实验数据进行模拟，利用式（）和计算机的非线性参数估算法计算。如果将数据点对时间作图，表明试虫中受试物浓度按照一定指

39、数下降，可用单室模型式（）描述消除阶段的时间过程。犆（狋）犆，犽狋（）消除过程有时似乎是双向的，表现为犆在早期阶段快速下降，而在后期变慢。这两个不同的阶段可以通过以下假设解释，即假设存在两个不同的隔室，受试物从每个隔室的消除速度不同。使用上述计算式时，通过将一阶动力学模型同样应用于吸收期和消除期的所有数据，也可以同时计算动力学参数（犽和犽）式（）。犆犽犽犆（犽狋）（犿）犽犽犆（犽（狋狋）犽狋）（犿）（）式中：“犿”为模型方程中的描述符，其作用为使计算机程序将式中的次级项正确分配到各个阶段（吸收和消除）的数据集并进行评价（犿代表吸收阶段，犿代表消除阶段）。犛犖犜 附录犅（资料性附录）土壤生物蓄积

40、试验的陆生寡毛类生物种类建议犅 蚯蚓犅 推荐的试验虫种为正蚓科犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪，自 年起划分为两个亚种（犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪和犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犪 狀犱 狉 犲 犻）。犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪具有节段状的亮黄色条纹，而犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犪 狀犱 狉 犲 犻则是均一的暗红色，可以通过以上特征对两个亚种进行识别。其起源可能为黑海地区，现在分布于世界各地，特别是在受人类活动改变的栖息地，如堆肥堆。两个亚种均可用于生物蓄积的生物毒理学试验。犅 犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪和犈 犻 狊 犲 狀

41、 犻 犪犪 狀犱 狉 犲 犻已有市售。同其他正蚓科蚯蚓相比，他们具有更短的生命周期，月月即可达到成熟期（室温条件下）。其最适宜温度为 ，喜好接近中性的潮湿的并富含有机物的基质。该类蚯蚓已被用于标准的生物毒理学试验，其饲养已有公认方法。犅 该种蚯蚓可在多种动物粪便中饲养，推荐的饲养介质为 的马粪（或牛粪）与泥炭的混合物。介质还应具备的条件包括：为（使用碳酸钙调节）、低离子电导率（低于或低于 的盐浓度）、不应过分的被氨或动物尿液所污染。无添加剂的商品园艺土、符合要求的人工土壤或这两种土壤按照 比例的混合土壤都可以用于本试验。基质应被润湿但不过度潮湿。饲养箱容积在 为宜。犅 为获得标准要求的虫龄和体

42、重，最好从虫茧阶段开始饲养。因此，将成虫放入含有新鲜基质的饲养箱中产茧，成虫密度应控制在 头成虫每千克基质（湿重）。后，将成虫移除。虫茧中孵化的蚯蚓应在饲养月 月（不包含第 月）内用于生物试验。犅 上述试虫健康的判断标准为：可从基质中穿行、不试图离开基质、可连续进行繁殖。当试虫移动缓慢或出现黄色尾端时，表明基质已耗尽，这种情况时，应加入新鲜基质或减少饲养箱中的试虫数量。犅 线蚓犅 推荐的试验虫种为犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻 犱狌 狊（），属于环节动物试虫家族线蚓科中最人的一类（可长达），并且分布于世界各地。主要存在于海水、淡水和陆地的腐烂有机物（海藻、堆肥）中，很少出

43、现在草地上。其广泛的生态耐受性和形态学变化表明，这一物种有可能存在不同的种属。犅 犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻 犱狌 狊作为鱼食已有市售，需对其种属在饲养过程中是否被体型较小的其他种属所污染进行判断。如存在种属污染，所有试虫均须在皮氏培养皿（）中水洗。利用立体显微镜（解剖显微镜）挑选出体型大的犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻 犱狌 狊重新进行饲养。该试虫生长周期较短，达到成熟期需（）到（）。试虫须在实验室内饲养至少周（一代）无异常后才可用于试验。犅 犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊属的其他种试虫也可用于试验，特别是新近发现的纯陆生线蚓种类犈狀

44、犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犾 狌狓狌 狉 犻 狅 狊 狌 狊。如选择其他种属的犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊，应清楚地进行辨识并报告选择该种试虫的理由。犅 犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犮 狉 狔狆 狋 犻 犮 狌 狊是一种与犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犾 狌狓狌 狉 犻 狅 狊 狌 狊属于同一组的线蚓。研究表明犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犮 狉 狔狆 狋 犻 犮 狌 狊对土壤性质（和质地等）有较强的耐受性，并且由于其繁殖和试验的简单性，经常被用于生态毒理学研究。但是，该类试虫体型较小（，平均），与犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻

45、犱狌 狊相比使得试验处理更加困难。该类线蚓的繁殖速度非常快，内（）即可完成一代，更高温度下繁殖速度更快。犛犖犜 犅 犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻 犱狌 狊（及其他犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊种）线蚓可在盛有混合了人工土壤和市售无添加剂污染的园艺土的大容积塑料箱（，体型较小的线蚓 ）中繁殖。应避免使用堆肥材料，因其可能含有重金属等毒性物质。饲养试虫前应将土壤深度冷冻三次以去除其他动物群。亦可使用纯人工土壤进行饲养，但试虫生殖率会低于混合基质土壤。土壤基质应在 。饲养应在 的无光保温箱中进行，任何时候都应避免温度高于。人工土壤或自然土壤应控制在湿润而非潮湿。其判断

46、标准为，当用手轻压土壤时，仅有小水滴出现在指缝间。当饲养箱上使用箱盖时，箱盖上应有足够的通气孔以保证空气供应，避免发生缺氧。应对饲养土壤进行每周一次的混合以曝气，混合时应小心操作勿使试虫发生伤亡。犅 应每周喂食一次试虫，将燕麦片置于土壤表面的孔穴中并用土覆盖。如上次喂食的食物仍有部分遗留于饲养箱内，应相应地调整喂食量。如遗留食物长菌，应清除并换为相同量的新鲜燕麦片。为刺激试虫繁殖，应在燕麦片的基础上增加含维生素的蛋白粉，每两周增加一次。饲养后，将试虫转移至新制备的饲养土壤基质。燕麦片应密封储存，使用前经高压灭菌或加热处理以避免感染粉螨（如犌 犾 狔 狕 狔狆犺 犪犵狌 狊）或捕食性螨类如犎狔狆

47、 狅 犪 狊 狆 犻 狊（犆狅 狊犿狅 犾 犪 犲 犾 犪狆 狊）犿犻 犾 犲 狊。消毒后的燕麦片应碾碎以利于分撒到土壤表面。啤酒酵母（药用酵母）也可作为试虫饲料。犅 一般情况下，当饲养条件齐备时试虫会快速地在土壤中移动，外表洁净无土壤颗粒黏附，有白色，不会试图离开土壤，并可观察到不同虫龄的试虫。此外，不断繁殖也可以说明试虫是健康的。犛犖犜 附录犆（资料性附录）人工土壤制备和储存建议犆 人工土壤组分由于特定来源的天然土壤不能保证全年均可获取，并且其固有生物以及微污染物的存在都可能影响试验，因此本试验建议使用符合 的人工土壤。许多测试生物可以在此类土壤中生存、生长和繁殖，并且此类土壤为试验的最大

48、标准化、实验室内与室间的试验可比性、培养条件均提供了条件。表犆 人工土壤组分组分含量具体要求泥炭 水藓泥炭，与 一致石英砂 工业石英砂（风干的），以上的粒径应在 ，所有石英砂粒径均高岭土 高岭石含量 碳酸钙，粉末状，化学纯可以选择将人工土壤中有机碳组分的含量降低，例如：将干燥土壤中泥炭的组分降低至，同时相应的增加石英砂的含量。这样的组分调整可能降低人工土壤对试验化学品的吸附能力，但增加试验化学品对试虫的有效性。已有研究表明在低有机碳含量的天然土壤（例如）中进行饲养时，犈狀 犮 犺狔 狋 狉 犪 犲 狌 狊犪 犾 犫 犻 犱狌 狊和犈 犻 狊 犲 狀 犻 犪犳 犲 狋 犻 犱犪能够达到繁殖的有效

49、标准，将人工土壤中泥炭含量降低至亦可获得相同效果。犆 制备直接将干燥的土壤组分混合（例如通过实验室用大容量混合机）。混合应在试验开始前一周完成。试验开始前应使用去离子水将混合后的土壤润湿至少，以平衡稳定其酸度。用比例的土壤与 的混合物进行测定。如果不在要求的范围内（），向土壤中加入足量的或重新制备土壤。通过 ：的方法对人工土壤的最大持水量（，）进行测定。在开始试验的两天前，向干燥人工土壤中加入足够量的去离子水或再生水（），使其含水量达到大约最终（试验过程中）含水量的一半。最终含水量应为 的 。试验开始时，将已预润湿的土壤按照试验组数和对照组数分为相应份数，并通过加入试验目标物和或加入去离子水或

50、再生水将含水量调致 的 。在试验开始和结束时应分别对土壤含水量进行测定（）。土壤含水量应达到试虫生存要求的最佳条件（含水量也可以通过下述方法检验：当用手轻压土壤时，仅有小水滴出现在指缝间）。犛犖犜 犆 储存人工土壤的干燥组分使用前可在室温下储存。已制备的、已润湿的土壤在添加待测物前应储存于阴凉处，储存时间不超过，并尽量减少水分挥发。已添加待测物的土壤应立刻进行试验，除非有信息表明经过储存不会对待测物的毒性和生物利用率有影响，且应按照推荐的条件进行储存。犛犖犜 附录犇（资料性附录）土壤生物蓄积试验例表犇 蚯蚓试验表犇 吸收期试验含动力学计算的次数据采集天数实验操作 土壤老化处理；将受试物溶液掺入