NY∕T 3282.2-2018 真菌微生物农药 金龟子绿僵菌 第2部分：金龟子绿僵菌悬浮剂(农业).pdf

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1、ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3282.2-2018 真菌微生物农药金龟子绿僵菌第2部分:金龟子绿僵菌油悬浮剂Fungal pesticides-Metarhizium anisopliae一Part 2:Metarhizium anisopliaeoil miscible flowable concentrate(OF)2018-07-27发布2018-12-01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3282.2-2018 目U吕NYj T 3282(真菌微生物农药金龟子绿僵菌分为3个部分:一一第1部分:金龟子绿僵菌母药;一-第2部分:金龟子绿

2、僵菌油悬浮剂;一一第3部分:金龟子绿僵菌可湿性粉剂。本部分为NYjT3282的第2部分。本部分按照GBjT1.1一2009给出的规则起草。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业农村部农药检定所、重庆大学、重庆重大生物技术发展有限公司。本部分主要起草人:王晓军、王中康、杨峻、殷幼平、郭明程、李向英、胡丽。I 1 范围真菌微生物农药金龟子绿僵茵第2部分:金龟子绿僵茵油悬浮剂NY/T 3282.2-2018 本部分规定了真菌微生物农药金龟子绿僵菌油悬浮剂的术语和定义、要求、试验方法、检验和验收，以及标志、标签、包装、储运、安全和保质期。本部分适用于由分生抱子母药添加适宜植物油

3、或油类介质并加人适量表面活性剂，经高速搅拌混合过滤而成的金龟子绿僵菌油悬浮剂。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 191 包装储运图示标志GB/T 1601 农药pH值的测定方法GB/T 1604 商品农药验收规则GB/T 1605 商品农药采样方法GB 3796 农药包装通则GB/T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 31737 农药倾倒性测定方法NY/T 3282.1 真菌微生物农药金龟子绿僵菌第1部分:金龟子绿僵

4、菌母药3 术语和定义Y/T 3282.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 绿僵菌油悬浮剂。iImiscible flowable concentrate(OF)由金龟子绿僵菌母药与适宜植物油或油类介质经混合而成的均匀分散的液体制剂。3.2 悬浮率suspensibility 油悬浮剂经油性稀释剂稀释混匀后，悬浮液中有效成分真菌分布的含抱量占总含抱量的百分率。4 要求4.1 组成和外观本产品由绿僵菌抱子母药和植物油或石蜡油加工而成，为黑色黠稠的油状液体，在存储过程中会有少量沉淀，经摇动应能恢复悬浮状态，不应有絮状结块。4.2 规范项目及指标金龟子绿僵菌油悬浮剂应符合表l的要求。NY/

5、T 3282.2-2018 5 试验方法5.1 一般规定除非另有说5.2 抽样按照GB/500 mL。采集后应立5.3 鉴别表1金龟子绿僵菌油悬浮剂控制项目指标项目指标化培养，观察菌落形态温酌侮毒军也4im.窑踵碰撞蝇盈菌丝体、句离噩噩噩疆理理盟盟理赔E主，ZJ，近源绿僵菌的形态学特一般NY/T 3282.5.4含5.4.1方采用玻璃纸球计数板计数抱5.4.2 试剂和溶液液体石蜡油或煤油。5.4.3 仪器及设备高速匀浆器:转速二三1000光学显微镜:目镜物镜=400倍。亮线血球计数板:25 X 16。微量移液器:0.2 mLl.0 mL。手动计数器:19 9990 容量瓶:100 mL。三角瓶

6、:250mL。5.4.4 试验步骤5.4.4.1 将试样搅拌均匀后，准确吸取试样Vj(约1.0 mL)2份，分别进行以下操作。5.4.4.2 将试样置于洁净三角瓶中，加人液体石蜡油60mL制成抱子悬浮液，并在高速匀浆器中海合NY/T 3282.2-2018 均匀后，转移至100mL容量瓶中定容、摇匀，配制成A悬浮液(稀释100倍)。5.4.4.3 用移液器准确吸取1.OmL A悬浮液至100mL容量瓶中，用液体石蜡油稀释至100mL(再稀释100倍)，并在高速匀浆器上、混合均匀后备用。5.4.4.4 在血球计数板上盖好盖玻片后，用微量移液器吸取抱子悬浮液，沿盖玻片上下边缘渗入盖玻片下，使其刚好

7、充满盖玻片与计数板记数区域之间。应无气泡，且计数区域四周无液体;如有多余液体，可用吸水纸吸去。5.4.4.5 用显微镜观察，待抱子静止后进行计数。在规划格区内，采取对角线5点取样的计数方法计数，上下区域各5个中格(16个小方格/中方格)，即双线范围内160小格(计数时，对于中格四周如有压线的抱子，计上双线不计下双线，计左双线不计右双线)的绿僵菌抱子数。5.4.4.6 每份试样点样、计数p次(=2)。5.4.5 测定结果试样中的含抱量Wj按式(1)计算。f(j X 400 X N5Nj .J.:1:.Q一一(1)160pVj X O.1 X 10-3 X 108 4Vj 式中:Wj 一一试样中的

8、含抱量，单位为亿抱子每毫升(亿抱子/mL);Kj 一一稀择倍数(10000倍);Nj 一-p次计数的总抱子数(上下区域各5个中方格中计数的总抱子数);400一一血球计数板计数室小方格总数为25X16=400;O.1一一血球计数板计数室体积，单位为立方毫米(mm3);10-3一一立方毫米换算为毫升(mL)的倍数;160一一血球计数板上下区域各5个中方格的小方格的总数(5X 16 X 2=160);p 一一计数次数(2次);Vj 一一试样量，单位为毫升(mL);108 一一代表108个抱子每毫升，ep亿抱子/mL。5.4.6 允许差2次平行测定结果相对差，应不大于20%，取其算术平均值作为测定结果

9、。5.5 活抱率测定金龟子绿僵菌油悬浮剂活抱率测定按照附录B的规定进行。5.6 杂菌率测定采用液体石蜡油对油悬浮剂样品进行适当稀释后，按照本部分5.4的方法测定并计算样品的杂菌率。5.7 细度测定(湿筛法)5.7.1 方法提要用煤油按比例稀释油悬浮剂，倒人用润湿试验筛中，将试验筛置于盛煤油的容器中，反复洗涤，移除筛中残余物，干燥，称重，计算绿僵菌样品的细度。5.7.2 试剂煤油。5.7.3 仪器及设备试验筛:孔径175m。电子天平:精度为0.001g。电热恒温干燥箱:控温误差土20C。3 NY/T 3282.2-2018 烧杯:250mL。烧杯:100mL。干燥器。玻璃棒。5.7.4 试验步骤

10、将试验筛浸入盛有煤油的盆中，使网筛完全润湿。准确称取混合均匀的试样100g(精确至O.001 g)，置于干燥的250mL烧杯中，用煤油稀释5倍并混匀，缓慢倒人试验筛中。用煤油洗涤烧杯3次，洗涤液也倒入试验筛中。将试验筛浸人煤油中(始终保持筛缘在液面之上)，左右摆动几次后提起试验筛，反复浸入和提起试验筛30次。更换煤油再如上操作，反复浸入和提起试验筛。将试验筛连同残余物放入烘箱中(100士2)OC烘至恒重，取出置于干燥器中冷却至室温，称重。5.7.5 测定结果油悬浮剂的悬浮物细度W2按式(2)计算。式中:W2=旦二旦旦X100 (2)m j W2一一油悬浮剂的悬浮物细度，单位为百分率(%);mj

11、 试样的质量，单位为克(g);m 2 残余物的质量，单位为克(g)。5.7.6 允许差2次平行测定结果相对差，应不大于20%，取其算术平均值作为测定结果。5.8 悬浮率测定按GB/T14825的规定进行测定。5.8.1 方法提要将试样于具塞量筒中，在(30士2)OC恒温箱内静置30min后，通过分别测定底部1/10悬浮液与上悬浮液的含抱量，计算绿僵菌样品的悬浮率。5.8.2 仪器及设备=角瓶:250mL。磨口具塞玻璃量筒:250mL(内径38.5 mm40 mm，刻度间距20.0 cm21.5 cm,250 mL刻度线与瓶塞底部间距4cm6 cm)。真空泵。恒温箱:控温误差士20C。光学显微镜

12、:目镜物镜=400倍。高速匀浆器:转速二三1000r/min。亮线血球计数板:25 X 16。微量移液器:0.2 mLl.0 mL。手动计数器:19999o5.8.3 试验步骤将250mL试样充分摇匀后倒入250mL具塞量筒，盖上瓶塞在1min内上下颠倒30次，使之充分均匀。直立量筒，打开塞子，用微量移液器快速从量筒中取样(1mL)，用于测定悬浮液的含抱量Cj(方法参照5.4)，再将具塞量筒放入(30士2)OC超级恒温器中静止恒温30min。轻轻取出，并用一接有真空泵的吸管将瓶中菌液由上液面逐渐向下吸出224mL，盛于三角瓶中(此为上悬液)，控制整个操作过程在15s30 s内完成。量筒中所剩抱

13、子悬浮液为下悬液，测定量筒底部剩余的25mL悬浮液，参照5.4.,.NY/T 3282.2-2018 的方法测定其含抱量C2，计算悬浮率。5.8.4 测定结果试样的总悬浮率W3按式(3)计算。W,=10 X 50c，-25c X 100=100 X ClOc,-C2)(3)9.,250c,9c,式中:W3一一试样的总悬浮率，单位为百分率c%);c)一静置前悬浮液含子包量，单位为亿抱子每毫升(亿抱子/mU;C2一一静置后底部1/10悬浮液含抱量，单位为亿抱子每毫升(亿抱子/mU。5.9 倾倒率测定倾倒后残留物的测定步骤中将具塞量筒静置30min，温度规定为(30:!:2)OC，用煤油溶液洗涤，按

14、照GB/T 31737进行测定。5.10 pH测定按GB/T1601进行测定。5.11 储存稳定性5.11.1 方法提要将试样密闭放置于50C储存12个月或150C250C储存6个月后，按照5.5的方法进行活抱率测定。储存后不低于活抱率初始值的80%。5.11.2 仪器及设备冰箱:50C。样品柜:室内控温范围Cl525)OC。棕色磨口玻璃瓶:带有磨口瓶塞，确保样品密闭。5.11.3 试验步骤将20g试样放在玻璃瓶中，使其铺成平滑均匀层，密封后置于50C冰箱中放置12个月或150C250C条件下放置6个月测定活抱率。6 产品的检验和验收应符合GB/T1604的规定。极限数值处理应按照GB/T81

15、70-2008中4.3.3的要求进行。7 标志、标签、包装、储运、安全和保质期7.1 标志、标签产品的标志、标签、应符合GB3796的规定，同时注明储运条件。7.2 包装包装应符合GB3796的规定和GB/T191的规定。7.3储运储运时应严防日晒及350C以上高温，置于阴凉干燥处。运输时，注意轻放，防止破损。不得与有毒有害物质?昆装、1昆运。7.4 安全在使用说明书或包装标签上应注明微毒及防护措施等。7.5 保质期在本部分规定储存条件下，质量保证期从生产日期算起，12个月内产品活抱率不低于标示值。5 NY/T 3282.2-2018 附录A(资料性附录)金龟子绿僵菌有效成分描述A.1 中文通

16、用名称金龟子绿僵菌。A.2 拉丁文学名Metarhiziumisopliae A.3 生物学分类地位菌物界、子囊菌门Ascomycota、盘菌亚门Pezizomycotina、粪壳菌纲Sordariomycetes、肉座菌亚纲Hypocreomycetidae、肉座菌目Hypocreales、麦角菌科Clavicipitace町、绿僵菌属Metarhizium、金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae。A.4 生物学特性A.4.1 菌落特征在1/4SDAY培养基上菌落初期白色，背面可见淡黄色色素，后期产抱后呈暗绿色，分生抱子聚集成堆。菌株可以在SDAY上280C生长一周，直径可达

17、3.5cm。A.4.2 形态特征菌丝具分枝分隔，粗1.4m2.1m。瓶梗型产于包细胞，大小幅度为(2.12.9)mX(7.1 7.5)mj从瓶梗顶端产生分生抱子链;抱子链连接点倾斜度小;分生抱子单细胞，长椭圆形至近柱状，两端钝圆形。分生袍子有时单生于菌丝分枝末端;分生抱子长度大于15m。A.4.3 核糖体基因分子鉴定结果通过菌株总DNA扩增、克隆转化、测定绿僵菌菌株的ITS1-5.8S rDNA-ITS2的特征序列。金龟子绿僵菌菌株的ITS1-5.8S rDNA-ITS2目的基因序列全长为552bp，其中5端包含部分18SrRNA 基因序列:149为部分18SrRNA基因序列。3端包含部分28

18、SrRNA基因序列:520552为部分28S rRNA基因序列。其余的则为ITS区:50195为ITS1区域全序列，196342为5.8S rRNA基因全序列，343519为ITS2区域的全序列。综合培养性状及形态特征以及ITS1-5.8-ITS2 rDNA分子克隆测序比对结果，鉴定该菌株为金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)。金龟子绿僵菌核糖体基因扩增序列见图A.1。TTTIrGCTTTAATTCAGCGGGTAGTCCTACCTGrTCGAGGTCAACTl叮AAAAAGTTGGGGGTTTTTACGGCAGTGGACCGCGCCGGGCTCCTGTTGCGAGTGT

19、TTTACTACTGCGCAGAGGAGGGCCACG GCGAGACCGCCAATCAATTTAAGGGACGGCTGTGCTGGAAAACCAGCCTCGCCGrCCCCAACAC CAAGTCCACAGGGGACTTGAGGGGCGTAATGACGCTCGAACAGGCrGCCCGCCAGAATACTGAC GGGCGCAATGTGCGTTCAAAG rTCGrGrTCACTG AATTCTGCAATTCACrTACTT rCGCrT TCGCTGCGTTCTTCrCGrGCCAGAACCAAGAGrCCGTTGTTGAAAGTTTTGrTCrTTTTTIT 6 NY/T 3282.2-

20、2018 TAACCACTCAGAAGTACTTTTAAAAAATTCAGAAGGTTTGGGTCCCCGGCGGGCGCGAAGTcc CGCCGAAGCAACAIGAAAGGTTAITCACAGGGGTTGGGAGTTGGTAACTCGGTAIGTCCC TCCGCAGGTTCACTAAACGGAAACA 图A.l金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)核糖体基因扩增序列A.5 有效成分主要存在形态分生抱子。A.6 生物活性感染鳞翅目、直翅目、鞠翅目多种害虫。A.7 适宜生长条件最适培养基为萨氏培养基(1/4SDAY);最适生长温度为280C。金龟子绿僵菌分生抱子及菌落形

21、态见图A.20 图A.2金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae分生抱子及菌落形态7 NY/T 3282.2-2018 附录B(规范性附录)玻璃纸片萌芽抱子显微计数法B.1 方法提要在无菌操作条件下，将绿僵菌可湿性粉剂样品用液体石蜡油适当稀释后，均匀涂抹在玻璃纸片上;再放人1/4SDAY平板，在(25:c1).C下培养24h，取玻璃纸制片镜检计数萌芽与未萌芽的抱子总数，计算抱子萌芽百分率。以抱子萌芽长度大于抱子长度的-半视为萌芽。-B.2 试剂和溶液液体石蜡油。B.3 仪器及设备高速匀浆器:转速注1000r/min 光学显微镜:目镜物镜=400倍。亮线血球计数板:25X16.微量

22、移液器:0.2 mL1.0 mL 手动计数器:19999。容量瓶:100 mL。-角瓶:250mL。B.4 测定步骤B.4.1 将萨氏培养基(1/4SDAY)在元菌条件下倒人直径为9cm培养皿中(每皿约15mL)，待其凝固后，放人大小为1cmX 1 cm的灭菌玻璃纸片。B.4.2 将试样混合均匀后，称取约0.01 g(精确至O.001 g)试样2份，分别进行以下操作。B.4.3 取30mL液体石蜡油配成约1.OX 107个袍子/mLf包子悬浮液，在高F勺浆器中混合均匀，再用接种环蘸取配制好的抱子悬浮液均匀涂于3片1/4SDAY平板内的玻璃纸片上B.4.4 在恒温箱内(25土1).C培养24h，

23、取3片玻璃纸片放于载玻片上。B.4.5 用锥蓝染色液滴于玻璃纸上，约2min后盖上盖玻片。B.4.6 在光学显微镜下观察并计数萌芽的抱子数与未萌芽的抱子数。B.4.7 计算其抱子萌芽百分率(以抱子萌芽长度大于抱子长度的-半视为萌芽)。B.4.8 每次计数至少300个抱子。3次测定结果的平均值作为1份试样的测定结果。B.5 测定结果试样的活抱率W4按式(B.1)计算。W4主!X 100.(B.1)式中:8,W4一一试样的活抱率，单位为百分率c%);N1一一萌芽抱子数，单位为个;N2一一检查于包子总数，单位为个。B.6 允许差NY/T 3282.2-2018 2次平行测定结果之差，应不大于20%，

24、取算术平均值作为测定结果。通过肉眼观察萌芽抱子的数量来计算单位绿僵菌油悬浮剂样品中的活抱子数量。9 ON|N.SSHMZ 中华人民共和国农业行业标准真菌微生物农药金龟子绿僵茵第2部分:金龟子绿僵菌油悬浮剂NY/T 3282.2-2018 争等中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址)中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销今6*争e开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张1字数20千字2018年11月第1版2018年11月北京第1次印刷书号16109 4644 定价25.00元长.*版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 2018