SC∕T 7221-2016 蛙病毒病检测方法(水产).pdf

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1、ICS 65.020.30 B 50:才叶|中华人民共和国水产行业标准SC/T 7221-2016 蛙病毒检测方法Detection method of ranavirus 2016-12-23发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布SC/T 7221-2016 目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业部渔业渔政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会CSAC/TC156)归口。本标准起草单位:北京市水产技术推广站、北京出人境检验检疫局、全国水产技术推广总站、中国检

2、验检疫科学研究院。本标准主要起草人:潘勇、张利峰、李清、徐立蒲、江育林、余E忠、张文、曹欢、王小亮、王妹、王静波、那立海、贾丽。I SCjT 7221-2016 蛙病毒检测方法范围本标准规定了蛙病毒病病原的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、概述、分离、鉴定和综合判定。本标准适用于蛙病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBj T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范3

3、术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 蛙病毒ranavirus 虹彩病毒科(lridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)中除流行性造血器官坏死病毒(Epizootichaemato poietic necrosis virus,EHNV)和欧洲姻病毒(Europeancatfish virus,ECV)外的其他成员。3.2 蛙病毒病infection with ranavirus 蛙病毒属的多种病毒(不包括流行性造血器官坏死病毒和欧洲细病毒)感染有尾和元尾目动物的一类系统性临床与亚临床感染。4 试剂和材料4.1 蛙病毒参考株:由农业部指定的水生动物病原微生物菌(毒)种保藏机

4、构提供。4.2 胖头跟肌肉细胞系(FHM)、鲤上皮瘤细胞系(EPC)、大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(CHSE)、蓝媳太阳鱼细胞系(BF-2):采用M199培养液培养。4.3 水:符合GB/T6682中一级水的要求。4.4 元水乙醇:分析纯，使用前预冷到一20.C。4.5 dNTP:含有浓度均为10mmol/L的dCTP、dGTP、dATP和dTTP，一20.C保存。4.6 Taq酶:10U/L，-20.C保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。4.7 引物:浓度为10mol/L。序列如下:上游引物F1:5-CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GA T-GT-3;下游引物R1:5-AAA-GAC-CCG

5、-TTT-TGC-AGC-AAA-C-3;扩增蛙病毒主要衣壳蛋白基因中585bp的片段。4.8 MgClz:25 mmol/L。4.9 琼脂糖:电泳纯。4.10 矿物油:要求元DNA酶和RNA酶。1 SC/T 7221-2016 5 仪器和设备5.1 解剖盘、剪刀、慑子、组织研磨器。5.2 倒置显微镜。5.3 生化培养箱。5.4 普通冰箱、超低温冰箱。5.5 低温离心机。5.6 超净台。5.7 PCR扩增仪。5.8 电泳仪。5.9 凝胶成像系统或紫外5.10 移液器、枪头、离6 蛙病毒概述病毒属CRanavir欧洲细病毒(Eu直径150nm 均能复制。等，并且7.1 采样长为30mm60 和内

6、脏。7.2 样晶处理应在100(以r/min离心20min，收集上7.3 病毒接种与观察对上清液10倍稀释两次，然idoviridae)蛙，EHNV)和，病毒粒子细胞质中tlgnnum s,STRV)000 IU/mL青霉孵育过夜。8000 释度的上清液接种到生长约24 h的96孔板里的FHM、EPC、CHSE坑DI由JL接种100L稀释液。220(吸附1h 后，加入细胞维持液，于220(250(培养。分别设置2孔阳性对照(接种参考株)和空白对照(未接种病毒的细胞)。对照和待测样品接种细胞7d内，每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应生长正常。被检样品细胞培养中出现CPE时，应立即进行鉴定;如果

7、只有阳性对照出现CPE，被检样品细胞培养中未出现CPE时，培养7d后盲传一次，出现CPE进行鉴定，仍未出现CPE.*iJ为阴性。如果阳性对照细胞也未出现CPE，需要重新进行病毒学检查。8 病毒的鉴定8.1 样品处理SC/T 7221-2016 收集出现CPE的细胞病变悬液450L，加人1.5 mL的离心管，再加人450LCTAB溶液(见A.3)并混匀。250C处理2h2.5 h。8.2 DNA抽提在含有样品的离心管中加入600L抽提液2(见A.5)，混合均匀至少30S o 12 000 r/min离心5mln，取上层水相(约800L)置于新的1.5 mL离心管中。再加人700L抽提液l(见A.

8、4)，混合至少30 S o 12 000 r/min离心5mm，取上层水相(约600L)置于新的1.5 mL离心管中。再加入一200(预冷的1.5倍体积的无水乙醇(约900L).倒置数次混匀后，一200(沉淀核酸8h以上。12000 r/min离心30 min，小心弃去上清液。干燥后加一凶I由国R模板。或采用同等功效的抽8.3 PCR扩增依次加人以下dNTP 2L，上游仪没有热盖，每扩增仪上，94min;40(保8.4 设立在7.胞悬代替取PCR扩增病毒种类的鉴定无条带出现9 综合判定从样品中分离到病毒并经都可判定为蛙病毒阳性。通过测序并进一步确认该病毒的种类。5 mmoL/L的MgC129L

9、，。如果使用的PCR扩增再将反应管置于PCR病毒参考株的细;取等体积的水板放人水平电人样品孔。在。在紫外灯下或步鉴定到种，可以进行比较，以进行蛙样品经PCR直接检测结果为阳性者，中已知的各种蛙病毒DNA序列比较后能3 SC/T 7221-2016 附录A(规范性附录)试剂及其配制A.1 细胞消化液(EDTAo.02%、膜酶0.06%PBS缓冲液)在10L灭菌的去离子水中，)1阴序加人80g NaCl、2g KCL 1 g KH2PO、2 3g Na2HP04 12H20。用4g6 g NaHC03调节pH至7.48.0。然后加入2g EDTA、6g膜酶，完全溶解后过滤除菌，分装，一200C保存

10、。A.2 细胞培养液按M199培养液(含Earles盐)说明书的要求，用一级水配制，然后加人10%经560C30 min灭活的胎牛血清，用NaHC03粉末调节培养液的pH为7.27.4。过滤除菌，分装后一200C保存。在开放系统使用时，需要加入过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0.02mol/L。A.3 CTAB溶液按CTAB2%,NaCl1.4 mol/L.EDTA 20 mmoL/L.Tris-HCl 20 mmoL/L,pH=7.5配制。用前加琉基乙醇至终浓度为0.25%。配制时，在60mL水中顺序加入8.19g NaCl、0.744g EDTA、1.21 g Tris,O.

11、25 mLO.3 mL浓HC1，iJ司整pH为7.58.0，再加人2gCTAB，搅拌待完全溶解后加水到100mL。使用前，需加琉基乙醇至终浓度为0.25%。A.4 抽提液1将氯仿:异戊醇按24:1的比例混合，密闭避光保存。A.5 抽提液2酣(1moL/L Tris饱和)氯仿:异戊醇=25:24:1混合，密闭避光保存。A.6 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)在1000 mL水中，分别加人54g Tris、27.5g棚酸、2.922g EDTA，用5mol/L的HCl调pH到8.0。A.7 EB(ethidium Bromide，核酸染色剂)用水配制成10mg/mL的浓缩液。避光保存。用时在每10m

12、L电泳液或琼脂中加lL。A.8 样晶缓冲液每100mL 水溶液中含澳酣蓝0.25g、煎糖40g。4 SCjT 7221-2016 附录B(资料性附录)蛙病毒3型主要衣壳蛋白的参考序列(585bp)蛙病毒3型主要衣壳蛋白的参考序列如下:CGCAGTCAAG GCCTTGATGT TTATGGTGCA GAACGTCACA CACCCTTCCG TCGGCTCCAA TTACACCTGC GTCACTCCCG TCGTGGGAGT CGGCAACACG GTCCTGGAGC CAGCCCTTGC GGTAGATCCC GTCAAGAGCG CCAGCCTGGT GTACGAAAAC ACCACAA

13、GGC TCCCCGACAT GGGAGTCGAG TACTACTCGC TGGTGGAGCC CTGGTACTAT GCCACCTCCA TCCCAGTCAG CACCGGGCAC CACCTCTACT CTTATGCCCT CAGCCTGCAG GACCCCCACC CATCCGGATC CACCAATTAC GGTAGACTGA CCAACGCCAG CCTTAACGTC ACCCTGTCCG CTGAGGCCAC CACGGCCGCC GCAGGAGGTG GAGGTAACAA CTCTGGGTAC ACCACCGCCC AAAAGTACGC CCTCATCGTT CTGGCCATCA ACCACAACAT TATCCGCATC ATGAACGGCT CGATGGGATT CCCAATCTTG TAAAGAGTAT TTTTCAGCGC AAAGTCTTTT CCGTCATGGG TCCTCCATGA TGGAAATAAA ACATGAAGTG TCCGTTTGCT GCAAAACGGG TCTTT 注:其他蛙病毒基冈序列参与-MI玛序.划线处为11物序列。3