SN∕T 2368-2009 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲 犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 狅 犿 犪 狋 狅狊 狆 狅 狋 狋 犲 犱狑 犻 犾 狋 狏 犻 狉 狌 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录、附录、附录、附录均为规范性附录，附录 为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：王秀芬、姜丽、刘伟、刘跃庭、王有福、刘善斌、周铭。本标准

2、系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了进境植物检疫中对番茄斑萎病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于所有进境种子、苗木等植物性繁殖材料中番茄斑萎病毒的检疫鉴定。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。进出境植物及植物产品检疫抽样原理 学名与分类地位学名：缩写：分类地位：布尼安病毒科（），番茄斑萎病毒属（犜 狅 狊 狆 狅 狏 犻

3、 狉 狌 狊）。检疫鉴定依据番茄斑萎病毒的血清学特性、分子生物学特性和生物学特性是检疫鉴定的主要依据。其他资料参见附录。仪器设备、用具及试剂 仪器设备酶联检测仪、天平（感量，）、计、微量榨汁机、仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器（，）、酶联板、研钵、管、花盆、消毒土等。试剂酶联免疫吸附测定试剂（见附录）、检测试剂（见附录）。抽样与样品制备 抽样抽样按照 的规定执行。种子样品制备将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于 生长并进行症状观察。待长出片片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（株为组）并编号。采集叶片用于酶联免疫测定、检测

4、及生物学测定。苗木样品制备将苗木种植于隔离温室中，于 生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同。犛 犖犜 检测方法 酶联免疫吸附测定见附录。犚 犜 犘 犆 犚检测见附录。实时荧光犘 犆 犚检测见附录。生物学测定见附录。结果判定酶联免疫吸附测定为阳性，检测或实时荧光 检测或生物学测定亦为阳性，可判定待检样品带有番茄斑萎病毒。样品保存 样品保存经检验确定携带番茄斑萎病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在，病株在 或者 冰箱中保存，做好标记和登记工作。结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手

5、人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，检测需有电泳结果图片，实时荧光 需有反应原始数据，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）番茄斑萎病毒相关资料犃 寄主范围 寄主范围非常广泛，（）所列的寄主名单包括 个科双子叶植物和个科单子叶植物的 余种植物。菊科 种和茄科 种豆科 余种易感染 。犃 病害症状 可引起多种症状，即使在同一种寄主植物上，也会因品种、年龄、营养状况和环境条件的不同有很大差异。病害症状见表 。表 犃 病害症状番茄叶子呈青铜色卷曲、出现坏死条纹和斑点，叶柄、茎和茎尖产生深褐色条纹。与健康植株相比，被害植株矮小。红色或黄色的番茄成熟时表皮出现暗

6、红色或黄色块斑。坏死严重时，导致植株死亡。辣椒整株矮化和黄化，叶片呈现褪绿线纹或花叶，并伴有坏死斑。茎上有坏死条纹延伸至顶芽。成熟果实上，可见带有同心环或坏死条纹的黄斑。莴苣植株受害后，从一侧叶片开始出现褪绿，并产生褐色斑纹。接着变色延伸至新叶，之后这一侧停止生长，呈现典型扭曲症。大岩桐受侵染叶片表现黄色或褐色斑或叶片变为栎叶状。凤仙花有些品种出现矮化、叶基变黑或叶片出现褐色叶斑。花生芽坏死、叶褪绿、萎缩和植株死亡。菊花不同品种症状差异很大，常见的症状有茎黑色条纹和萎蔫。犃 分布地区番茄斑萎病毒是一种分布广泛且具有经济重要性的植物病毒，分布于欧洲和地中海地区、亚洲、非洲、北美洲、中美洲和加勒比

7、海、南美洲和大洋洲。犃 传播方式 容 易 通 过 介 体 蓟 马（主 要 包 括犜 犺 狉 犻 狆 狊狋 犪 犫 犪 犮 犻、犜狊 犲 狋 狅 狊 狌 狊、犜狆 犪 狉 犿 犻、犉 狉 犪 狀 犽 犾 犻 狀 犻 犲 犾 犾 犪狊 犮 犺 狌 犾 狋 狕 犲 犻、犉狅 犮 犮 犻 犱 犲 狀 狋 犪 犾 犻 狊、犉犳 狌 狊 犮 犪和犛 犮 犻 狉 狋 狅 狋 犺 狉 犻 狆 狊犱 狅 狉 狊 犪 犾 犻 狊）以持久性方式进行自然传播，机械接种和嫁接也可传播，还可以随寄主植物（盆栽或种植材料）进行国际间传播，特别是这些寄主带有介体时，更容易传播该病毒。犛 犖犜 附录犅（规范性附录）双抗体夹心酶

8、联免疫吸附测定犅 试材犅 酶联板的要求使用质量有保证厂商生产的酶联板。犅 包被抗体特异性的番茄斑萎病毒抗体。犅 酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的番茄斑萎病毒抗体。犅 底物对硝基苯磷酸二钠（狆 ）犅 样品抽提缓冲液（狆 犎 ）亚硫酸钠（）（）叠氮钠（）储存。犅 包被缓冲液（狆 犎 ）碳酸钠（）碳酸氢钠（）叠氮钠（）蒸馏水定容至，储存。犅 犘 犅 犛 犜缓冲液（洗涤缓冲液狆 犎 ）氯化钠（）磷酸氢二钠（）磷酸二氢钾（）氯化钾（）吐温 蒸馏水定容至。犅 酶标抗体稀释缓冲液（狆 犎 ）（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉 （）叠氮钠（）储存。犅 底物（狆犖 犘 犘）缓冲液（狆 犎 ）氯化镁（）叠氮钠（）二乙醇胺 犛

9、犖犜 溶于 蒸馏水中，用盐酸（）调 值至，蒸馏水定容至，储存。犅 程序犅 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，孔，加盖，孵育，清空孔中溶液，洗涤次，每次 。犅 样品制备待测样品按（重量体积）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，离心 ，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。犅 加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，孔，每一样品设一重复。加盖后于冰箱孵育过夜，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤次，洗涤次，每次 。犅 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，孔，加盖，孵育，酶联板用自来水彻底冲洗

10、，再用蒸馏水洗涤次，洗涤次，每次 。犅 加底物将底物狆 加入到底物缓冲液中使终浓度为 （现配现用），按 孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。犅 读数在不同的时间内如 、或更长时间，用酶联仪在 处读 值，或用肉眼观察显色情况。犅 结果判断犅 对照孔的 值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的 值小于 ，当阴性对照孔的 值小于 时，按 计算；阳性对照 值阴性对照 值大于；同一样品的重复性基本一致。犅 在满足了 质量要求后，结果原则上可判断如下：样品 值阴性对照 值大于，判为阳性；样品 值阴性对照 值接近阈值，判为可疑样品，需重新做一次，或者任选、和 中的

11、一种方法加以验证；样品 值阴性对照 值明显小于，判为阴性。犅 若满足不了 质量要求，则不能进行结果判断。犛 犖犜 附录犆（规范性附录）犚 犜 犘 犆 犚检测犆 试剂犆 提取缓冲液 ，氯化钠（）亚硫酸钠（）犆 犜 犃 犈 冰醋酸 加去离子水定容至。用时加水稀释至 。犆 加样缓冲液溴酚蓝 蔗糖水溶液（质量浓度）犆 实验步骤犆 总 犚 犖 犃提取将 植物叶片组织放入液氮冷冻，研磨成粉状；加入 提取缓冲液与磨碎的组织充分混匀；，孵育 ；用三氯甲烷异戊醇（）抽提两次；上清液用等体积的 氯化锂在下过夜沉淀；下 犵离心 ；用 含十二烷基硫酸钠（）的 缓冲液悬浮沉淀；加入 和 冰异丙醇在 下孵育 ；，犵离心

12、后，用 乙醇洗沉淀，留沉淀，风干；用 处理水悬浮沉淀，保存。也可采用其他有效的 提取方法。犆 犚 犜 犘 犆 犚反应犆 引物序列 犆 合成按表 组分制备 反应混合液。反应条件：，。犛 犖犜 表 犆 各组分浓度和用量试剂名称浓度用量 （）引物 （）（）样品 犆 在冰上依次将表 组分加入上述 混合液中。充分混匀后进行下列热循环：；，个循环；。表犆 各组分浓度和用量试剂名称浓度用量引物 （）（）总体积 犆 琼脂糖电泳犆 制备凝胶将 和电泳级琼脂糖按（质量浓度）配好，在微波炉中熔化混匀，冷却至 左右。犆 加溴化乙锭加入溴化乙锭浓度为 ，混匀，倒入已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台

13、上除去封带，拔出梳子，加入足够量的 （缓冲液没过凝胶表面约）。犆 电泳用加样缓冲液与样品混合，然后将其和适合的 分子量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察并保留结果。犆 结果判断犆 阳性对照在 处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。犆 结果达到质控要求，且样品在 处无扩增条带，判定结果为阴性。犛 犖犜 附录犇（规范性附录）实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚（犜 犪 狇 犕 犪 狀）检测植物和单个蓟马中的犜 犛 犠犞犇 引物按 核蛋白基因保守序列设计的寡核苷酸引物和探针：蓟马引物和探针肌动蛋白基因内设计：犇 犚

14、 犖 犃提取犇 从植物中提取取 植物叶片组织在液氮中研磨成粉状。用 提取缓冲液混合样品。孵育 。三氯甲烷：异戊醇（）抽提两次。水相用等体积 氯化锂下过夜沉淀 。犵，离心 。用 含 的 悬浮沉淀。氯化钠和 冷异丙醇在 下孵育 。犵，下离心 ，乙醇洗，沉淀，干燥。用 处理水悬浮沉淀，保存。犇 从蓟马中提取将单个昆虫放入 离心管中加入 处理水（在冰上操作）浸软。每个样品中加入 （，）（）。加热 。犵，离心 。弃沉淀，上清 保存。犇 实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚（犜 犪 狇酶）试验步骤将表 成分加入反应管中（在冰上），制备 酶反应混合液。表 犇 各组分浓度和用量试 剂 名 称终浓度用量备注 （）（）（

15、）犛 犖犜 表 犇（续）试剂名称终浓度用量备注 （）样品 总体积 按下列程序进行实时 ：；，个循环。犇 结果判定荧光阈值循环（）表示每个 反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环，值小于，结果为阳性。值大于，结果为阴性。犛 犖犜 附录犈（规范性附录）生物学测定犈 接种病叶加（质量体积）的磷酸盐缓冲液（，）于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面，自来水冲洗叶表。犈 寄主症状黄瓜（犆 狌 犮 狌 犿 犻 狊 狊 犪 狋 犻 狏 狌 狊）：子叶上表现坏死中心的褪绿斑，非系统性。矮牵牛（犘 犲 狋 狌 狀 犻 犪犺 狔 犫 狉 犻 犱 犪）：

16、坏死局部斑，非系统性。克利夫兰烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 犮 犾 犲 狏 犲 犾 犪 狀 犱 犻 犻），心叶烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪犵 犾 狌 狋 犻 狀 狅 狊 犪），普通烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 狋 犪 犫 犪 犮 狌 犿）、黄花烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 狉 狌 狊 狋 犻 犮 犪）：局部坏死斑，系统坏死症和叶畸形。凤仙花属植物（犐 犿 狆 犪 狋 犻 犲 狀 狊）：接种叶褪绿到坏死斑或环，系统褪绿到坏死斑。蔓陀罗（犇 犪 狋 狌 狉 犪 狊 狋 狉 犪 犿 狅 狀 犻 狌 犿）：接种叶褪绿和坏死斑和环，系统花叶和斑驳。烟（犖 犻 犮 狅 狋 犻 犪 狀 犪 犫 犲 狀 狋 犺 犪 犿 犻 犪 狀 犪）：接种叶褪绿到坏死环斑，系统褪绿、矮化。番茄（犔 狔 犮 狅 狆 犲 狉 狊 犻 犮 狅 狀 犲 狊 犮 狌 犾 犲 狀 狋 狌 犿）：接种叶褪绿到坏死斑和环，系统花叶、系统褪绿和坏死斑。注：指示植物在 下生长，内表现症状。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准番茄斑萎病毒检疫鉴定方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元