NY 882-2004 硅酸盐细菌菌种(农业).pdf

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1、ICS 65.080 B 10 中华人民共和国农业行业标准NY 882-20 硅酸盐细菌菌种Silicate-Dissolving bacteria culture 2005-01-04发布2005-02-01实施中华人民共和国农业部发布NY 882-2004 I-E 本标准的附录A、附录B、附录C、附录D和附录E为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位:农业部微生物肥料质量监督检验测试中心。本标准主要起草人:曹凤明、李俊、沈德龙、姜昕、葛一凡。前NY 882-2004 硅酸盐细菌菌种范围本标准规范了农用硅酸盐细菌菌种的特征、要求、检验方法、评价方法以及菌种的纯化、

2、复壮和保藏。本标准适用于农用微生物菌剂和微生物肥料生产中使用的硅酸盐细菌菌种。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T 798-20 复合微生物肥料GB/T 17419-1998 含氨基酸叶面肥料NY/T 301-1995 有机肥料速效梆的测定3 术语硅E量盐细菌菌种Silicate-DisIving Bacteria Culture 是指一类在土壤中能通过

3、自身的生命活动，分解硅铝酸盐类矿物，释放饵索营养，改善植物的营养条件，并具备生产应用性能的细菌纯培养物。4 菌种特征硅酸盐细菌菌种包括胶质芽抱杆菌(Bacillusmuclaginosus)和土壤芽抱杆菌(Bacillus eda户hicllS)两个种。4.1 细胞形态营养体粗长杆状，两端钝圆，革兰氏染色反应不定，产生聚R经基丁酸盐(PHB)颗粒。在瑞养基A.l上(参见附录A)菌体大小为(1.0-1.2)mX(2.5-7.0)m，菌体周围有厚英膜。芽泡:壁厚，椭圆形，中生或近端生，芽泡囊不膨大或微膨大。4.2 菌落形态在A.l培养基平板上，菌落圆形，元色，隆起，胶质和稠，透明或半透明，边缘整齐

4、。4.3 生物学特征好氧或兼性厌氧生长，水解淀粉，接触酶反应阳性，氧化酶和卵磷脂酶反应阴性，在元氮培养基(参见附录A.2)上生长良好，生长温度10c-45 c。5 5.1 5.2 要求菌种要求纯培养物.无杂菌。硅酸盐细菌菌种技术指标见表I。NY 882-2004 表1硅酸盐细菌菌种技术指标项目指标解何能力速效柳相对增加量，%二注20 发醉植物激素且量.mglL 二三1.0 代由t游离氨基酸且盐，吨IL二注50,0 产物有机酸总量，mglL 二主500,0 耐热能力芽抱存活率，锁，二主70 发酵周期，h s豆 6 检验方法6.1 菌种纯度检验在适宜培养基上培养，观察菌落和菌体形态，若有杂菌丢弃或

5、对其进行纯化，纯化方法见8.1.2。6.2 解饵能力的测定速效例相对增加量的测定方法见附录B。6.3 发酵代谢产物测定6.3.1 发酶条件在适宜培养条件下，发酵周期结束后取样测定发酵液中代谢产物的含量。以不接种的发酵培养液作对照。发酵培养基见附录A.3。6.3.2 植物激素的测定见附录C。6.3.3 游离氨基峻的测定见附录D。6.3.4 有机酸的测定见附录E。6.4 芽抱存活率测定6.4.1 iJ!定方法菌悬液在65t条件下恒温30min杀死营养体，制成芽抱悬液。芽抱悬液于80t恒温水浴处理10mm，将处理前和处理后的芽抱悬液稀释涂布在适宜培养基上，适宜条件下培养2d-4 d，计菌落数。3次重

6、复。活菌数测定方法按NYf 798-2004复合微生物肥料中5.3.2的要求进行。6.4.2 芽抱存活率计算按式(I)讨算式中-a一-芽于包存活率(%);a(%)=主x1 00.,(J)。no一一处理前芽抱悬液的菌落平均数(cfu/mL);llJ 处理后芽抱悬液的菌落平均数(cfu/mL)。65 发醉周期的检验适宜生产条件下，当发酵液中的菌体数量达到10cfu/mL以上且有80%以上的营养体形成芽抱为2 NY 882-2004 发酵周期终止。7 评价方法7.1 菌株符合表l中的各项指标，可以作为优良生产商株。7.2表1中其他三项符合要求，而发酵代谢产物仅两项达到要求或其中项达到要求的两倍，也可

7、作为生产菌株。7.3 当硅酸盐细菌菌种用做生产液体剂型时，对耐热能力不做要求。8 菌种纯化、复壮和保藏8 1 菌种分离与纯化8.1.1 分离将土壤或其他样品和j成菌悬液，稀释后涂布A.l培养基平板上，适宜条件下培养2d-4 d，挑取符合硅酸盐细菌菌种特征的菌落进行纯化。8.1.2 纯化在适宜的培养基上连续划线培养观察，直至商落形态一致，镜检菌体大小整齐、元杂菌。根据硅酸盐细菌的特征进行菌种确认。8.2 复壮菌种生长速度下降、菌体形态出现异常、主要功能指标下降时需要进行菌种复壮。具体操作方法是将菌种接种在适宜的土壤或载体中，也可将菌种转接在含有土壤浸出液的培养基上2-3代，培养一段时间后再分离，

8、挑取与原菌种特征致的菌落，纯化，同时按表1中的要求进行测试。83菌种保藏8.3.1 短期保藏常用的保藏方法是斜面保藏法，挑选菌苔丰满、无污染的斜面菌种置于4t-8t下保存。3个月左右转接一次。8.3.2 长期保磁菌种形成芽泡后进行长期保存，采用两种或两种以上的方法保存，并制备多个备份。常采用的保藏方法有:冻干管法、甘油管法、石蜡油覆盖法、沙土管法等。3 NY 882-2004 A.l 硅E量盐细菌培养基i.f.糖Na,HPO,MgSO,7H,O ca)，FeCl36H,O pH 琼脂蒸馆水A.2 无氮培养基阿须贝(Ashby)培养基甘露醇KH,PO,MgSO,7H,O NaCI CaC,CaS

9、O,2H,O pH 琼脂蒸馆水A.3 测定发酵代谢产物用发酵培养液玉米淀粉豆饼粉K,HPO,MgSO,7H,O MnSO,H,O ca马F的36H,O pH 蒸馈水4 附录A(规范性附景)选择培养基5.0 g 2.0 g 0.5 g 0.1 g 5mg 7.5-8.5 18.0-20.0 g 1.0L 10.0 g。.2g 0.2 g 0.2 g 5.0 g 0.1 g 7.0-7.5 18.0-20.0 g 1.0L 8.0 g 2.0 g 2.0 g 0.5 g 0.5 g。1g 5mg 7.0-7.5 1.0L b B.1 原理附录BI规范性附录解饵能力测定NY 882-2004 硅酸盐

10、细菌能够分解硅铝酸盐矿物，将矿物态饵转变为可溶性例为菌体自身或植物所利用，通过测定培养液中速效惆含量的相对增加量来确定菌种的解仰能力。B.2 材料和试剂B.2.1 材料含例矿石粉树长石，磨碎，粒径。075mm以下。B.2.2试剂20%H，o，溶液。B3 培养液B.3.1 种子液淀粉酵母膏K,HPO,MgSO,7H20 eaco,FeCl36H,O pH 蒸馆水B.3.2 发酵液煎糖MgSO,7H,O(NH,),SO,NaCl eaco,何长石粉pH 蒸倒水B.4 测定方法步骤B.4.1 锦长石处理5.0 g 1.0 g 2.0 g 0.5 g 0.1 g 5mg 7.5-8.5 1.0L 10

11、.0 g 0.5 g 0.2 g 0.1 g 0.1 g 5.0 g 7.2-7.5 1.0L 愣民石粉用20%HCl溶液淋洗(酸洗，洗去速效仰和缓效饵).再用蒸饱水淋洗至中性。8.4.2种子液制备5 NY 882-2004 挑取环活化好的斜面菌种接入50mL种子培养液中，150r/min摇床，适宜源度下培养到对数期，菌体含量不少于2X 108 cfu/mL。B.4.3 发酵液制备500mL三角瓶加入解何发酵液95mL.高压灭菌备用。接人种子液5mL，同时做加入等量灭活种子液的发酵液为对照，在28c、摇床150r/min条件下培养7 d，设置3个重复。B.4.4发酵液的处理过氧化氢灰化法将全部

12、发酵液转入蒸发皿中，在水浴锅中浓缩至IOmL左右，加2.0mLH，o，溶液，继续蒸发，并不断搅动，反复加20%H，o，溶液几次至秸性物质完全消化。3500r/min离心10min，将上清液收集在50mL容量瓶中，用蒸馆水定容，然后测定溶液中速效饵含量。B.4.5 速效御的测定按NYIT 301-1995规定执行，对第6章试样的制备、第7章分析步骤中的7.1和7.3标准曲线绘制进行修改。B.4.5.1 试样的制备按3.4.4的要求执行。B.4.5.2 分析步骤试样溶液制备参见NY11 301-1995 7.1.将称取试样5.00g改为吸取试样5.00mLo 吸取何标准溶液。.1.00.2.00.

13、3.00.4.00.5.00，7.50，10.00mL分别置于8个50mL容量瓶中。加10.00mL硝酸溶液，用水定容。此溶液1mL中含铮(K)0,2.00.4.00.6.00.8.00.10.00,15.00.20.00阔的标准溶液系列。在火焰光度计上用空白溶液调节仪器零点，以标准溶液系列中的最高浓度的标准溶液调节仪器满刻度至80分度处，测量其他标准溶液，记录仪器示值。根据钳浓度和仪器示值绘制校准曲线或求出直线回归方程。B.5 速效钢相对增加量6 按式(2)计算:一ma=77、100(2)式中a 速效例相对增加量(%);P。一一试样中速效僻的含量(mg!L)(灭活种子发酵液对照);P，一一试

14、样中速效仰的含量(mg!L)(接种发酵液)。NY 882-2004 附录C(规范性附录)发酵液中植物激素的测定C.l 原理植物生长素赤莓素(GA，)、巧|噪乙酸(1M)和细胞分裂素玉米素(Z)、异戊烯基腺瞟岭(IPA)等蝶岭衍生物都溶于甲醉，可用甲醇提取发酵液中的植物激素。植物生长索和细胞分裂家的分子结构不同，在反相Cl8柱上保留时间不同，调整流动相中各组分的比例，可使各组分定量分离。因此采用反相液相色普法可对植物生长素和细胞分裂素定量测定。C.2试lIJ乙脯色i曹纯;甲醇:优级纯并经0.5m滤膜过滤;植物激素标准品:色1普纯;磷股:优级纯，水.重蒸并经0.45m滤膜过滤。植物生长素标准溶液分

15、别称取植物生长素标准品(赤霉素GA呵|牒乙酸1M)各0.0020 g(+0.0001)，用甲醇溶解并定容至25.0mL。细胞分裂素标准浴液:分别称取细胞分裂京标准曰I(玉米絮Z.异戊烯基腺瞟岭IPA等)各O.0040g(+O.o 1)，用甲静溶解并定容至25.0mL。C.3 仪器高效液相色谱仪(HPLC)，具紫外检测器。C.4 测定方法C.4.1 生长素C.4.1.1 试样帘l备取10.00mL发酵液于50mL锥形瓶中，减压浓缩干后，1m入50mL冷叩醉在5C左右进行也声波振荡2h，经0.5m滤脱过滤，1IIi液待测。C.4.12 色谱条件a)色谱柱:C8，0.4cm X25 cm:b)流动相

16、:15%CH,CN,40%CH,OH,45%H，O(用同用4调pH至4.0);c)检测器:UV254 nm x O.I AUFS;d)进样量:10L;e)流速:0.7mL/mino C.413 标准样晶测定在上述色谱条件下，吸取植物生长素标准溶液LOL进样分析，得到GA，、1M色谱图，记录各组分保留时间和峰面积。重复进样3次，取各组分峰面积平均值。C.4.1.4 试样溶液测定在同一色谱条件下，吸取试样溶液10L进样分析，以外标法计算样品中各组分含量。C.4.1.5 计算7 i NY 882-2004 附录E(规范性附录)发醉液申有机隘的测定E.1 原理发酵液中有机酸主要有，拧棱酸、就泊酸、苹果

17、酸、奎尼酸、乙股等。这些有机酸溶于水，因其分子结构不同，在反相C8柱上保留的时间不同。通过调节流动相的pH，可使几种有机酸依次分离。E.2 试剂拧镶酸、玻珩酸、苹呆酸、奎尼酸、乙酸，均为分析纯。水重蒸并经0.45m滤膜过滤。磷酸:优级纯。标准溶液制备:称取以上五种有机酸标准品各20mg于IOmL容量瓶中，用流动相溶解并定容。E.3 仪器高效液栩色谱仪(HPLC)，其紫外检测器。E.4 样晶处理取发酵液样品10.00mL于100mL膜过世:，泼、液待测。巾，用流动相(见E.5)稀释并定容，摆匀后经0.45m洁、E.5 E.6 色i曾条件色谱性:C8，0.4cmX 25 cm;流动相:H，O(用H3P04诩pH至3.5);流速:0.8 mL/min;进样景:10L;检测器:UV214nmxO.IAUFS。标准样品测定在上述色i普条件下，吸取标准溶液10L进样分析，得到各组分色谱图，记录各组分保留时间和峰面积。重复进样3次，取各组分峰而积平均值。E.7 试样溶液测定在同-色i苗条件下，吸取试样溶液10L进样分析，以外标法计算样品中各组分含量。E8 计算按(7)式讨算.Zp.v,p=-亏.,.,.,.(7)式中:JO p一一样品中有机酸的总量(吨IL);p一-样品中第z种有机酸的含量(mglL);V，-一样晶莹(mL);V2一样品定容体积(mL)。NY 882-2004 1 I