SN∕T 3267-2012 国境口岸炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片检测方法(出入境检验检疫).pdf

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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 国境口岸炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片检测方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犪 狀 狋 犺 狉 犪 犮 犻 狊犫 狔犵 犲 狀 犲 狊 狌 狊 狆 犲 狀 狊 犻 狅 狀犪 狉 狉 犪 狔犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验

2、检疫科学研究院、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙肖红、韩辉、杨宇、文海燕、王惠兰、胡孔新、张顺合、王静。犛 犖犜 国境口岸炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片检测方法范围本标准规定了国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片的检测方法和程序。本标准适用于国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌的检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全适用要求。人间传染的病原微生物名录（卫生部）术语和定义下列术语和

3、定义适用于本文件。炭疽芽胞杆菌犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犪 狀 狋 犺 狉 犪 犮 犻 狊炭疽芽胞杆菌属于芽胞杆菌属，是急性传染病炭疽的病原体，为粗大的革兰氏阳性杆菌，具有强烈的致病性、传染性和生存能力。人类可以通过直接或间接接触炭疽芽胞杆菌引起皮肤、肺和肠道感染，导致皮肤炭疽、肺炭疽和肠炭疽。由于曾经被用作细菌战剂，尤其是 年美国发生炭疽恐怖事件之后，炭疽芽胞杆菌更加受到全球的密切关注。基因悬浮芯片犵 犲 狀 犲 狊 狌 狊 狆 犲 狀 狊 犻 狅 狀犪 狉 狉 犪 狔基因芯片是将探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测探针分子的杂交信号强度，进而获得样品分子的数量和

4、序列信息。基团悬浮芯片是近年来新出现的一种可对多指标同时进行定性、定量分析的新型芯片技术，是一种既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台。悬浮芯片体系由许多不同的微球为主要基质构成，每种微球上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于固定探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些微球悬浮于一个液相体系中，就构成了一个悬浮芯片系统。荧光强度中位值犿 犲 犱 犻 犪 狀犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲 犻 狀 狋 犲 狀 狊 犻 狋 狔，犕 犉 犐用仪器检测结果时，读取一种编号微球群 个或以上的每个微球信号强度的统计平均值。犛 犖犜 仪器和设备 悬浮

5、芯片系统美国 ）或其他产品。微孔滤板吸滤器，气泵。酶标板振板器。仪。超声波破碎仪。试剂与耗材 犘 犆 犚相关试剂参见附录。基团悬浮芯片检测相关试剂参见附录。其他 碘化 钠；乙 醇；饱 和 酚；三 氯 乙 烷；玻 璃 粉；的 次 氯 酸 钠 溶 液（含 有 效氯）。捕获探针 ：引物 （上游引物）：（下游引物）：，扩增产物长度为 。（上游引物）：（下游引物）：，扩增产物长度为 。耗材 微球：）或其他代理公司的任何编号的羧基化荧光编码微球。链亲和素 藻红蛋白：，。）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。血球计数板。基因液相

6、芯片的制备（探针与微球的偶联）将已经分装好的碳化二亚胺（）粉末从 取出，回温至室温。将氨基化探针用纯水配置终浓度为 溶液。犛 犖犜 将原包装中的微球振荡，超声。取 微球至 离心管，犵离心 ，小心吸出上清液。微球重悬于 的 中，振荡，超声。将浓度为 的探针溶液加于微球悬浮液中，振荡混匀。用双蒸水新鲜配制 溶液。向每个装有微球的 离心管中加入 新鲜配制的溶液，振荡混匀。将 离心管置涡流振荡器上，室温避光孵育 。再次向每个装有微球的 离心管中加入 新鲜配制的 溶液，振荡混匀。将 离心管置涡流振荡器上，室温避光孵育 。向各 离心管中加入 吐温 ，振荡混匀，犵离心 ，小心吸弃上清液。向各 离心管中加入

7、，振荡混匀，犵离心 ，小心吸弃上清液。向各 离心管中加入 ，振荡，超声，使微球重悬。即为偶联好的微球。微球的计数：用血球计数板计数。吸取适量微球，稀释后，用血球计数板（；）在普通光学显微镜下计数。计算公式：微球数量每个大格数 稀释倍数体积（）。记录微球浓度。偶联好的微球保存备用（保存有效期年）。基团悬浮芯片的检测方法 样品的处理 在生物安全柜内，向 可疑粉末状样品中加入 ，混匀，犵离心 ，取上清液。将上清液 犵离心 ，弃上清液，保留沉淀。沉淀中加入 ，混匀，犵离心 ，保留沉淀。重复上一步骤次，沉淀用于提取核酸。样品核酸的提取）本文件推荐上述核酸提取方法，也可以使用其他效果相同的方法。向每份样本

8、中加入 ，振荡混匀，煮沸。犵离心 ，将上清液转至另一含 玻璃粉液的 离心管中。充分混匀，室温放置 ，使暴露的 吸附于玻璃粉上；犵离心 ，小心倾去上清液。向玻璃粉 沉淀中加入 乙醇，充分混匀，犵离心，小心倾去上清液。重复上一步骤，然后置于 恒温箱内干燥。向上述干燥的玻璃粉 沉淀中加 ，充分混匀，加热 ，犵离心 ，回收上清液备用。犵离心 ，回收上清液。用紫外分光光度计测定 吸光度值，确定 的浓度，备用。犘 犆 犚扩增目的基团 以上述核酸提取步骤中制备的上清液作为 反应的 模板。犛 犖犜 体系的配制。设 反应体系，每个体系的组成如下：缓冲液；犜 犪 狇（热启动酶）；上游引物（终浓度为 ）；下游引物（

9、终浓度为 ）；模板；无菌双蒸水 。注：同时设阴性对照和阳性对照。阴性对照为反应体系中模板 用无菌双蒸水代替，阳性对照为反应体系中模板 用合成的质粒 （包含引物扩增的片段）代替。反应条件：预变性，扩增 个循环，。杂交 偶联探针的微球各 个混于 杂交液中，置于 离心管中。向各管中加 产物使其终体积为，吹打混匀。变性 ；随后 反应 。按 孔用 润湿 孔滤板，同时将洗液（）预热至杂交温度。用 杂交液制备 为终浓度 染色工作液。用真空泵将滤板内 抽干，再将杂交体系转入滤板孔内，然后抽干。取杂交温度下预热的洗液，按 孔加入待测滤板孔内并抽干，重复本步骤次。按 孔将 染色工作液加入待测孔内，并用封口膜封住孔

10、口。在室温和避光条件下，将滤板先 振摇 ，再以 振摇 。染色后，将滤板抽干，再按 孔加入 洗去未结合 并抽干，重复两次。向各孔加入 ，摇振 使微球悬起，并上机检测。结果判断 质量控制反应结果应同时符合以下个条件，否则实验结果无效：空白对照为不加检测样品，用 代替，其 值为背景信号强度；阴性质控为以 阴性对照进行杂交检测，其 值低于背景信号强度；阳性质控为以 阳性对照进行杂交检测，其 值应远远大于背景信号强度（大于 倍）；荧光质控为联结 的微球，其 值应远远大于背景信号强度（大于 倍）；偶联质控为加入生物素标记的与探针序列互补的寡核苷酸，检测值应远远大于背景信号强度（大于 倍）。结果分析及报告

11、待检样品的 值介于背景信号强度倍时（处于灰度区间），建议重复检测一次。待检样品的 值大于检测背景信号强度倍以上时即判为炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片检测犛 犖犜 阳性。注：引物 阳性表示为炭疽芽胞杆菌阳性，如果同时 阳性，则表示该样品炭疽芽胞杆菌为强毒株。待检样品的 值小于检测背景信号强度时判为炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片检测阴性。生物安全措施根据 人间传染的病原微生物名录 要求，本实验应在生物安全级实验室中进行。实验操作时穿戴防护设备，如手套、实验服、口罩。检测中的废液先加入含氯消毒液（）进行处理，所用的溶液和废弃物经高压灭菌处理。检测仪器使用后经 的含氯消毒液处理（见 ）。犛 犖犜 附录犃（资料性附

12、录）犘 犆 犚相关试剂犃 反应预混液。犃 聚合酶：。犃 。犃 缓冲液。犃 。犛 犖犜 附录犅（资料性附录）基团悬浮芯片检测相关试剂犅 ：氯化四甲铵（）。犅 ：犖吗啉 乙磺酸（犖 ）。犅 ：碳化二亚胺（）。犅 杂交液：见表。表 犅 犜犕犃 犆杂交液配制方法试 剂 名 称终浓度 中用量 月桂酰 犖 甲基氨基乙酸钠（），乙二胺四乙酸（）双蒸水 犅 杂交液：见表。表犅 犜犕犃 犆杂交液配制方法试 剂 名 称终浓度 中用量 月桂酰犖 甲基氨基乙酸钠（），乙二胺四乙酸（）双蒸水 犅 ：十二烷基磺酸钠。犅 ：（），（）。犅 ：磷酸盐缓冲液。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元