DB51∕T 2852-2021 普通级实验用猫 微生物学监测(四川省).pdf

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1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 DB51 四川省地方标准 DB51/T 28522021 普通级实验用猫 微生物学监测 Conventional experimental catPathogenic surveillance 2021-11-08 发布 2022-01-01 实施 四川省市场监督管理局 发 布 DB51/T 28522021 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 检测要求.1 5 检测程序.2 6 检测方法.3 7 检测规则.4 8 结果判定.5 9 检测结论.5 附录 A（规范性）猫泛白细胞减少症病毒 PCR 检测

2、方法.6 附录 B（规范性）猫疱疹病毒 I 型 PCR 检测方法.8 附录 C（规范性）猫杯状病毒 RT-PCR 检测方法.10 附录 D（规范性）猫狂犬病病毒巢式 RT-PCR 检测方法.12 附录 E（规范性）猫白血病病毒巢式 RT-PCR 检测方法.14 附录 F（规范性）沙门氏菌荧光定量 PCR 检测方法.16 附录 G（规范性）皮肤病原真菌多重 PCR 检测方法.17 附录 H（规范性）猫传染性腹膜炎病毒 RT-PCR 检测方法.18 DB51/T 28522021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本

3、文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省科学技术厅提出、归口并解释。本文件起草单位：四川省农村科技发展中心、四川农业大学、四川省药品检验研究院。本文件主要起草人：周紫峣、陈兵、邹弈星、王敬东、姚凌云、彭广能、荣祖元、黎家敏。本文件首次发布。DB51/T 28522021 1 普通级实验用猫 微生物学监测 1 范围 本文件规定了普通级实验用猫微生物学监测的检测要求、检测程序、检测方法、检测规则、结果判定和检测结论的要求。本文件适用于普通级实验用猫的微生物学监测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期

4、的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 14926.50 实验动物 酶联免疫吸附试验 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 NY/T 564 猪巴氏杆菌病诊断技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。实验用猫 experimental cat 经人工饲育，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检验检测以及其他科学实验的猫。普通级实验用猫 conventional experimental cat 不携带所规定的重要人兽共患病病原和猫烈性传染病病原的实验用猫。4 检测要求

5、 临床观察 普通级实验用猫临床观察应符合下列要求：被毛整齐平整不粗乱；头、尾、躯干、四肢正常无缺损；眼、鼻、口、耳、肛门、泌尿生殖器开口清洁，没有异常分泌物；行走正常；粘膜颜色正常。DB51/T 28522021 2 检测项目 普通级实验用猫微生物检测项目应符合表1的规定。表1 普通级实验用猫微生物检测项目 微生物 检测要求 猫泛白细胞减少症病毒 猫疱疹病毒I型 猫杯状病毒 猫狂犬病病毒 猫白血病病毒 沙门氏菌 皮肤病原真菌 猫传染性腹膜炎病毒 多杀巴斯德杆菌 注1：必检项目，指在进行实验用猫质量评价时应检测的项目，可以免疫。注2：必检项目，指在进行实验用猫质量评价时应检测的项目，要求阴性。注

6、3：必要时检测项目，指申请生产许可证、引进实验用猫或怀疑本病流行等必要时要求检测的项目。5 检测程序 普通级实验用猫检测程序应符合图1的要求。DB51/T 28522021 3 a 检测结果存疑，需要进一步确诊时，应结合临床症状和前期检测结果，按照表2中检测方法的要求采集动物组织或特定样本进行进一步检测。图1 检测程序 6 检测方法 普通级实验用猫微生物检测方法应符合表2的要求。表2 普通级实验用猫微生物检测方法 微生物 检测方法 适用范围 猫泛白细胞减少症病毒 GB/T 14926.50 抗体检测 应符合附录A的规定 核酸检测 猫疱疹病毒I型 GB/T 14926.50 抗体检测 应符合附录

7、B的规定 核酸检测 DB51/T 28522021 4 表2 普通级实验用猫微生物检测方法（续）微生物 检测方法 适用范围 猫杯状病毒 GB/T 14926.50 抗体检测 应符合附录C的规定 核酸检测 猫狂犬病病毒 GB/T 14926.50 抗体检测 应符合附录D的规定 核酸检测 猫白血病病毒 应符合附录E的规定 核酸检测 沙门氏菌 应符合附录F的规定 核酸检测 皮肤病原真菌 应符合附录G的规定 核酸检测 猫传染性腹膜炎病毒 应符合附录H的规定 核酸检测 多杀巴斯德杆菌 NY/T 564 核酸检测 注：猫泛白细胞减少症病毒、猫疱疹病毒I型、猫杯状病毒、猫狂犬病病毒为免疫要求项目，应按照本标

8、准中“抗体检测”要求，检测70%以上的抗体合格率，在发现疑似症状时应使用本标准中“核酸检测”要求，判定阴性以排除。7 检测规则 检测频率 每6个月应至少检测1次。采样 7.2.1 方式及数量 7.2.1.1 应选择 6 月龄以上实验用猫随机抽样。7.2.1.2 普通级实验用猫抽样数量应符合表的 2 要求。表3 普通级实验用猫采样数量 单位：只 群体数量 采样数量 100a 应不少于10 100500 应不少于20 500 应不少于30 a 群体数量低于 10 只时，应全部采样 7.2.2 方法 7.2.2.1 可按微生物、寄生虫采样要求联合采样。7.2.2.2 采样方法按照 NY/T 541

9、进行。7.2.3 送检要求 DB51/T 28522021 5 样本应有明显标识，写明样品名称、品种、品系、等级、数量及检测项目等内容，由专人按照生物样本包装和运输方式送达实验室。8 结果判定 抗体检查 免疫项目，免疫密度应达到100%，免疫抗体合格率70%，判为合格。非免疫项目，血清抗体阴性，判为合格。抗原和核酸检查 未见阳性结果，判为合格。9 检测结论 上述各项指标均合格，应判定为实验用猫符合普通级标准要求；有任一指标不合格，应判定实验用猫不符合普通级标准要求。DB51/T 28522021 6 A A 附录A （规范性）猫泛白细胞减少症病毒 PCR 检测方法 A.1 待测样本 DNA 的

10、提取与保存 将样本按照DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA，冻存于-70冰箱备用。A.2 PCR 反应引物 根据vp2基因序列设计 上游引物序列（5-3）：CTGCTACTCAGCCACCAACT 下游引物序列（5-3）：TGGTGGTAAGCCCAATGCTC A.3 对照设立 从样品处理开始应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原体或质粒添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为空白对照。A.4 PCR 反应体系及条件 A.4.1 PCR反应体系 20L体系

11、包括10PCR buffer（含Mg2+）2L，dNTP（2.5mM）1.6L，上下游引物（10M）各1L，Taq酶（5U/L）0.5L，模板DNA 2 L，最后用灭菌双蒸水补齐。A.4.2 PCR反应条件 94预变性5min；94变性30s，55退火30s，72延伸1min，35个循环；72延伸10min。A.5 PCR 产物 A.5.1 产物大小 401bp。A.5.2 产物参考序列 CGTCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATG

12、AGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATGTATATCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGAAAATTCTGTACCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTTTTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCA。DB

13、51/T 28522021 7 A.6 结果判定 阳性对照出现401bp的目的片段，阴性对照无条带，实验判定成立；待检样品出现401bp目的片段，判定猫泛白细胞减少症病毒阳性；未出现401bp目的片段，判定猫泛白细胞减少症病毒阴性。DB51/T 28522021 8 B B 附录B （规范性）猫疱疹病毒 I 型 PCR 检测方法 B.1 待测样本 DNA 的提取与保存 将样本按照DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA，冻存于-70冰箱备用。B.2 PCR 反应引物 根据tk基因序列设计 上游引物序列（5-3）：GCGGATTACACCACCACTCT 下游引物序列（5-3）：AAAGGCTAAG

14、GGCGTGTACC B.3 对照设立 从样品处理开始应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原体或质粒添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为空白对照。B.4 PCR 反应体系及条件 B.4.1 PCR反应体系 20L体系包括10PCR buffer（含Mg2+）2L，dNTP（2.5mM）1.6L，上下游引物（10M）各1L，Taq酶（5U/L）0.5L，模板DNA 2 L，最后用灭菌双蒸水补齐。B.4.2 PCR反应条件 94预变性5min；94变性30s

15、，54退火30s，72延伸1min，35个循环；72延伸5min。B.5 PCR 产物 B.5.1 产物大小 409bp。B.5.2 产物参考序列 GCGGATTACACCACCACTCTCGATTGGATTGTATTCGGCGAGCTTGGTAATATTAGCAGCCAGAACAGAAATGTTACTCGTAAGCATCTGCGGGGGTAAACTAGTAACTCCCAAAATTCTCAGACCGCGCTGCGCGATAAATGCCAATATGGGTATTAGAGTGAGCTTCTCCCCCCCTGGTGGTAGAATCTTGGTTATTAAACCCACAGAATCTGTTAATTGTTTC

16、AAACCCTCACGACGTTGAATGTCTTTACTAGTTGTATCATATTTTTTGAAAAACGACACGTTTTCAGCTCAATTAGAAAACATATACCACCCCCTTCTCCCTCAAATTGTATAGTACATACACAATCAGGTCGGCGACGACCCAAGTTAACCTCACATGCTAGGTACACGCCCTTAGCCTTT。DB51/T 28522021 9 B.6 结果判定 阳性对照出现409bp的目的片段，阴性对照无条带，实验判定成立；待检样品出现409bp目的片段时，判定猫疱疹病毒I型阳性；未出现409bp目的片段时，判定猫疱疹病毒I型阴性。DB5

17、1/T 28522021 10 C C 附录C （规范性）猫杯状病毒 RT-PCR 检测方法 C.1 病毒 RNA 的提取 按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于-70保存、备用。C.2 PCR 反应引物 上游引物序列（5-3）：AACCTGCGCTAACGTGCTT 下游引物序列（5-3）：CAGTGACAATACACCCAGAA C.3 对照设立 从样品处理开始应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原体或质粒添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸

18、水作为空白对照。C.4 反转录 使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNA。C.5 PCR 反应条件 95预变性5min；95变性30s，55退火40s，72延伸1min，30个循环；72延伸2min。C.6 PCR 产物 C.6.1 产物大小 926bp。C.6.2 产物参考序列 AACCTGCGCTAACGTGCTTAAATACTATGATTGGGATCCCCACATCAGATTGGTTATCAACCCCAATAAATTTCTTCCTATTGGTTTCTGTGATAATCCTCTAATGTGTTGCTACCCAGAATTGCTCCCAGAATTCGGAACTGTGTGGGATTG

19、TGATCAATCCCCACTGCAAATCTACCTGGAGTCAATCCTTGGTGATGATGAATGGGCTTCAACTTACGATGCCATTGACCCTGTTGTTCCACCAATGCACTGGGACGATGCAGGCAAGATCTTCCAACCTCACCCTGGAGTTCTGATGCATTTTCTAATAAATGAAGTTGCAAAGGGCTGGGATCCAAGTTTGCCATCCTTCCGTTTGGAAGCAGATGACGGATCCATAACCACACCTGAACAGGGTACTGCGGTTGGTGGCGTCATTGCCCAACCCAGCGCTCAAATGTCGGCAGCTGC

20、AGACATGGCATCTGGTAAGAGTGTTGACTCTGAGTGGGAGGAATTCTTTTCCTTCCATACTAGTGTCAACTGGAGCACAACTGAAACACAAGGAAAGATTCTGTTCAAACAGTCACTGGGACCCCTTCTCAACCCTTACCTTGAACACTTATCTAAACTCTATGTTGCTTGGTCAGGCTCTATAGATGTTAGGTTTTCTATCTCTGGTTCTGGTGTCTTTGGGGGAAAACTAGCCGCAATAGTTGTCCCACCTGGTGTCGATCCTGTCCAAAGCACTTCCATGCTACAATACCCTCATGT

21、GTTGTTTGATGCTCGACAGGTTGAACCAGTGATCTTTTCTCTCCCTGATCTGAGGAATTCACTATATCACCTCATATCTGATACTGATACTACATCTCTGGTAATAATGGTTTACAATGATCTTATTAACCCCTATGCAAATGAAGCTAACTCTTCTGGGTGTATTGTCACTG。DB51/T 28522021 11 C.7 结果判定 阳性对照出现926bp的目的片段，阴性对照无条带，实验判定成立；待检样品出现926bp目的片段时，判定猫杯状病毒阳性；未出现926bp目的片段时，判定猫杯状病毒阴性。DB51/T 28522021

22、 12 D D 附录D （规范性）猫狂犬病病毒巢式 RT-PCR 检测方法 D.1 病毒 RNA 的提取 按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于-70保存、备用。D.2 PCR 反应引物 D.2.1 第一次反应引物 上游引物序列（5-3）：GTGTAACACCTCTACAATGG 下游引物序列（5-3）：ACAGTCTCYTCNGCCATCT D.2.2 第二次反应引物 上游引物序列（5-3）：CAAGATGTGYGCYAAYTGGAG 下游引物序列（5-3）：AGCCCTGGTTCGAACATTCT （简并引物，其中Y=C/T，N=A/C/G/T）D.3 对照设立 从样品处理开

23、始应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原体或质粒添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为空白对照。D.4 反转录 使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNA。D.5 PCR 反应条件 D.5.1 第一次PCR反应条件 以制备的cDNA为模板，进行第一次PCR反应，条件如下：95预变性5min；95变性30s，56退火30s，72延伸30s，30个循环；72延伸2min。D.5.2 第二次PCR反应的条件 以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR反

24、应，条件如下：95预变性5min；95变性30s，56退火30s，72延伸30s，30个循环；72延伸2min。D.6 PCR 产物 D.6.1 产物大小 239bp。DB51/T 28522021 13 D.6.2 产物参考序列 CAAGATGTGCGCTAACTGGAGTACCATCCCGAACTTTAGATTCTTAGCTGGAACCTACGACATGTTTTTCTCTCGGATTGAGCATTTGTACTCAGCTATAAGAGTGGGCACAGTTGTCACTGCTTATGAAGACTGCTCAGGGTTGGTATCGTTCACAGGGTTCATAAAGCAAATAAATCTCACC

25、GCGAGAGAGGCAATCCTATATTTCTTCCACAAGAACTTTGAGGAAGAAATAAGAA。D.7 结果判定 阳性对照出现239bp的目的片段，阴性对照无条带，实验判定成立；待检样品出现239bp目的片段时，判定猫狂犬病病毒阳性；未出现239bp目的片段时，判定猫狂犬病病毒阴性。DB51/T 28522021 14 附录E （规范性）猫白血病病毒巢式 RT-PCR 检测方法 E.1 病毒 RNA 的提取 按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于-70保存、备用。E.2 PCR 反应引物 E.2.1 第一次反应引物 上游引物序列（5-3）：ACAGCAGAAGTT

26、TCAAGGCC 下游引物序列（5-3）：GACCAGTGATCAAGGGTGAG E.2.2 第二次反应引物 上游引物序列（5-3）：GCTCCCCAGTTGACCAGAGT 下游引物序列（5-3）：GCTTCGGTACCAAACCGAAA E.3 对照设立 从样品处理开始应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原体或质粒添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为空白对照。E.4 反转录 使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备cDNA。E.5 PCR 反应

27、条件 E.5.1 第一次反应条件 以制备的cDNA为模板，进行第一次PCR反应，条件如下：95预变性5min；95变性45s，58退火30s，72延伸1min，35个循环；72延伸7min。E.5.2 第二次反应条件 以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，条件如下：95预变性5min；95变性45s，58退火30s，72延伸1min，35个循环；72延伸7min。E.6 PCR 产物 E.6.1 产物大小 601bp。E.6.2 产物参考序列 DB51/T 28522021 15 GCTCCCCAGTTGACCAGAGTTCGACCTTCCGCCTCATTTAAACTAACCAATC

28、CCCATGCCTCTCGCTTCTGTACGCGCGCTTTCTGCTATAAAACGAGCCATCAGCCCCCAACGGGCGCGCAAGTCTTTGCTGAGACTTGACCGCCCCGGGTACCCGTGTACGAATAAACCTCTTGCCGATTGCATCTGACTCGTGGTCTCGGTGTTCCGTGGGCGCGGGGCCTCATCGCCGAGGAAGACCCAGTTCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATAGAGACCCCCAACCCCCGGGACCACCGACCCACCATCAGGAGGTAAGCTGGCCGGCGACCATATCTGTTGTCC

29、TTGTATAAGTGTCTCTGTCAATTGATCTGATTTTGGCGGTGGGATCGAAGGAGCTGACGAGCTCGTACTTCGCCCCCGCAACCCTGGAAGACGTTCCACGGGTGTCTGATGTCTGGAGCCTCTAGTGGGACAGCCATTGGGGCTCATCTGTTTGGGGTCTCACCTGAATACAGGGTGTTGATCGGAGACGAGGGAGCCGGACCCTCAAAGTCTCTTTCTGAGGTTTCATTTTCGGTTTGGTACCGAAGC。E.7 结果判定 阳性对照出现601bp的目的片段，阴性对照无条带，实验判定成立；待检样品出现601

30、bp目的片段时，判定猫白血病病毒阳性；未出现601bp目的片段时，判定猫白血病病毒阴性。DB51/T 28522021 16 E E 附录F （规范性）沙门氏菌荧光定量 PCR 检测方法 F.1 样本 DNA 的提取与保存 将样本按照DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA，提取的DNA于-70保存、备用。F.2 荧光 PCR 引物及探针 上游引物序列（5-3）:GCCAAGCCTAAAACCAGTAAAGG 下游引物序列（5-3）:GTCCTAGCGACGTTCCTTCTTTT 探针（5-3）:FAM-CAGCCGCTCAGTATTG-NFQ F.3 对照设立 从样品处理开始应设置阳性对照、阴性

31、对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原菌或质粒添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为空白对照。F.4 荧光 PCR 反应体系及条件 F.4.1 荧光PCR反应体系 20L体系包括2Mix buffer 10L，引物探针混合液1L，模板DNA 2L，最后用灭菌双蒸水补齐。F.4.2 荧光PCR反应条件 95预变性10min；95变性15s，60延伸1min，40个循环。F.5 结果判定 阳性对照Ct值35，有明显荧光扩增曲线，阴性对照无Ct值，并且无荧光扩增曲线，实验判定成立；

32、待检样品有荧光扩增曲线，且Ct值35，判定沙门氏菌阳性；待检样品无荧光扩增曲线，或Ct值35，判定沙门氏菌阴性。DB51/T 28522021 17 F F 附录G （规范性）皮肤病原真菌多重 PCR 检测方法 G.1 样本 DNA 的提取与保存 将样本按照DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA，提取的DNA于-70保存、备用。G.2 PCR 反应引物 表 G.1 PCR 反应引物 被检病原 引物序列（5-3）目的基因 片段长度（bp）石膏样毛廯菌（须毛廯菌）TAGGGCCAAACGTCCGTCA ITS1ITS2 146 GGTCCAGCGTTTAGCCACTAA 石膏样小孢子菌 GACAAT

33、CAACTCCCTGGAT ITS1ITS2 390 GTCCTAGAGGCGTTGGTT 犬小孢子菌 TGCGGAAGGATCATTAACG ITS1ITS2 290 CTCGCTCAGACGGTATGT G.3 对照设立 从样品处理开始应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原体或质粒添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为空白对照。G.4 PCR 反应体系及条件 G.4.1 PCR反应体系 20L体系包括10PCR buffer（含Mg2+）2L，dNTP

34、（2.5mM）1.6 L，所有引物（10 M）各0.5 L，Taq酶（5U/L）0.5L，模板DNA1L，最后用灭菌双蒸水补齐。G.4.2 PCR反应条件 94预变性3min；94变性30s，60退火30s，72延伸45s，35个循环；727min。G.5 PCR 产物 产物大小：146bp、290bp和390bp。G.6 结果判定 阳性对照出现146bp、290bp和390bp目的片段，阴性对照无条带，实验判定成立；待检样品出现任一目的片段时，判定皮肤病原真菌阳性；未出现目的片段时，判定皮肤病原真菌阴性。DB51/T 28522021 18 G G 附录H （规范性）猫传染性腹膜炎病毒 RT

35、-PCR 检测方法 H.1 病毒 RNA 的提取 按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行，提取的RNA于-70保存、备用。H.2 PCR 反应引物 上游引物序列（5-3）：GTGATGCTATCATGACTAG 下游引物序列（5-3）：CACCATTACAACCTTCTAA H.3 对照设立 从样品处理开始应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原体或质粒添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为空白对照。H.4 反转录 使用反转录试剂盒对所提RNA进行反转录，制备

36、cDNA。H.5 PCR 反应条件 以制备的cDNA为模板，进行第PCR反应，条件如下：95预变性5min；95变性30s，48退火35s，72延伸45s，30个循环；72延伸5min。H.6 PCR 产物 H.6.1 产物大小 417bp。H.6.2 产物参考序列 GTGATGCTATCATGACTAGGTGTCTTGCTATATATGATTGTTTTGTCAAACGTGTAGATTGGTCCATTGTGTACCCTTTTATTGAAAATGAAGAGAAGATCAATAAAGCTGGTCGCATTGTACAATCACATGTCATGAGAGCTGCTCTTAAAGTTTTCAACCCTGC

37、TGCAATTCACGATGTTGGTAATCCAAAAGGTATTCGTTGTGCTGCGACACCCATACCGTGGTTTTGTTATGACCGTGATCCTATTAATAACAATGTTAGATGTCTGGAGTATGATTACATGGTACATGGACAAATGAATGGTTTAATGTTGTTTTGGAATTGTAACGTAGACATGTACCCAGAGTTCTCAATTGTCTGTAGATTTGATACTCGGACCCGCTCAAAATTGTCATTAGAAGGTTGTAATGGTG。H.7 结果判定 阳性对照出现417bp的目的片段，阴性对照无条带，实验判定成立；待检样品出现417bp目的片段时，判定猫传染性腹膜炎病毒阳性；未出现417bp目的片段时，判定猫传染性腹膜炎病毒阴性。