SC∕T 7224-2017 鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法(水产).pdf

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1、ICS 65.020.30 B 41:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7224一2017鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法Detection method by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for spring viraemia of carp virus 2017-06-12发布2017-10-01实施中华人民共和国农业部发布SC/T 7224-2017 目。吕本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不

2、承担识别这些专利的责任。本标准由农业部渔业温政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本标准起草单位:全国水产技术推广总站、深圳市检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局、暨南大学食品安全与研究院。本标准主要起草人:郑晓聪、贾鹏、李清、王津津、余卫忠、何俊强、于力、刘莹、兰文升、史秀杰、刘盔、秦智锋、石磊。I SC/T 7224-2017 鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增(RT一LAMP)检测方法1 范围本标准给出了鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增CRT-LAMP)检测的技术原理，规定了试剂和材料、器材和设备、操作步骤及结果判断。本标准适用于鲤春病毒血症

3、病毒的初筛检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 15805.5 鱼类检疫方法第5部分:鲤春病毒血症病毒CSVCV)GB/T 18088 出入境动物检疫采样SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范3 缩略语下列缩略语适用于本文件。AMV酶:AMV逆转录酶Cavianmyelobastosis virus reverse transcriptase)Bst酶:BstDNA聚合酶(大片段)Bst

4、 DNA PolymeraseClarge fragment)DEPC:焦碳酸二乙醋Cdiethylpyrocarbonate)dNTP:脱氧核昔三磷酸Cdeoxyribonucleoside triphosphate)EDTA:乙二股四乙酸Cethlenediamine tetraacetic acid)PBS:磷酸盐缓冲溶液Cphosphatebuffer saline)RT-LAMP:逆转录环介导等温扩增Creverse transcription loop-mediated isothermal amplifica-tion)SVCV:鲤春病毒血症病毒Cspringviraemia o

5、f carp virus)4 技术原理本标准根据SVCVC参见附录A中A.1)基质蛋白基因，设计了4条引物(参见附录B)特异性识别基因组中的6个区域。在AMV酶和链置换Bst酶的作用下，630C恒温扩增60min，即可实现SVCV核酸扩增。而后，在扩增反应后加入显色液，即可通过观察颜色变化判定结果。5 试剂和材料5.1 水:符合GB/T6682中一级水的规格。5.2 DEPC水:配制方法见附录C中C.1或购买商品化试剂。5.3 磷酸盐缓冲液CPB曰:配制方法见C.2或购买商品化试剂。5.4 Trizol试剂:商品化试剂，40C保存。5.5 三氯甲皖:分析纯，避光常温保存。5.6 异丙醇:分析纯

6、，使用前预冷至一200C。l SC/T 7224-2017 5.7 引物:SVCV-FIP:5-CGCTTGTTCCT AGAACCTTTGT AA TTTTTCCCTTGAAGACGA TGTCAG-3，40mol/L备用;SVCV-BIP:5-TACAGATTGATCATGTTCCGTTGTGTTTTTGGAATACAAGGCCGACC-3，40mol/L备用;SVCV-F3:5-GGAT ATACAA TTGGACACC-3，10mol/L备用;SVCV一B3:5-ACAACTTCCTTGCACCTT-3，10mol/L备用。5.8 10XThermoPol缓冲液:商品化产品国国gllJ

7、Tris-HCl、0.1mol/L氯化饵、0.1mol/L 硫酸镀、20mmol/L硫酸臻、1%T 5.9 dNTPs:含dATP、5.10 甜菜碱:浓度55.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 5.17 5.18 5.19 6.1 6.2 6.3无6.4 11品6.5 6.6 6.7 6.8 元菌剪刀、慑子、离心6.9 消毒设备。7 操作步骤7.1 样品采集7.1.1 采样对象鲤、锦鲤和金鱼等易感鱼类(参见A.2)。7.1.2 采样水温与数量应在水温13.C21.C间进行，采样数量应符合SC/T7103的要求。7.1.3 样晶采集按GB/T18088的规定执行。对有临床症

8、状(参见A.3)的鱼，体长6cm的鱼取脑、肝、肾、脾;对元症状的鱼取肾、脾、肝和脑组织。成熟雌鱼还需取卵巢液。7.2 样品处理将样品置于预冷的无菌研钵中匀浆，然后用预冷的PBS以1:10(m/v)重悬，5000g 40C离心10 min，取上清液待检;若待检样品为病毒的细胞培养物，可直接用于核酸提取。7.3 设立对照设置空白对照、阴性对照和阳性对照。7.4 RNA抽提分别取200L待检样品匀放置5min;加人200L相至一新的离心管中，加弃上清液，沉淀用1DEPC7.l溶解阳lARNA提取也在O.2 阳性对照的也可7.5.2 反应条件各样品置于恒温金属浴或恒温水7.6 结果观察打10次20次，

9、室温in;12000 g离，心10min;干燥5min;加20L在KT-LAMP扩增结束后的反应管中加入2L显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。8 结果判断8.1 空白对照和阴性对照反应管液体呈橙色，阳性对照反应管液体呈绿色时结果成立。8.2 待检样品反应管液体呈绿色，则判断该样品SVCV初筛阳性;待检样品反应管液体呈橙色，则可判断该样品SVCV检测结果为阴性。3 SC/T 7224-2017 附录A(资料性附录)鲤春病毒血症病毒(SVCV)A.1 生物学特性鲤春病毒1Il且症病毒CSpring Viraemia of Carp Virus,SVCV)是单分子负链RNA病毒，隶属于弹状病毒科C

10、Rhabdoviridae)鲤春病毒属CSprivivirus)，是引起鲤春病毒血症CSpring Viraemia of Carp,SVC)的病原，常在春季流行于鲤科鱼特别是在鲤鱼中，引起幼鱼和成鱼死亡。A.2 易感鱼类SVCV的宿主范围很广，包括鲤CCyrinuswcario)、锦鲤CCy户rznuscar户iokoi)、鳞CArislichthys nobilis)、草鱼CCtenopharyngodonidellus)、链CHypohthalmichthysmolitrix)、细CCarassiusuratus)、丁螃CTinca)、欧馀(Silurusglanis)等。A.3 临床症

11、状感染SVCV的鱼类常常聚集在池塘的进水口，呼吸困难、活力下降，并伴有死亡，这是SVC暴发的早期信号。病鱼对外界剌激反应迟钝、游动速度逐步下降，发病后病鱼几乎停止游动、身体失去平衡。有些死于池底，有些在池塘边缘无方向性的游动或无意识漂游。病鱼体色发黑，眼球突出，腹部膨大，虹门红肿，体表(皮肤、鳝条、口腔)和鲸充血。鱼恩和体表伴有淤血，眼部可能出现症状，虹门发炎、水肿、突出。病鱼体色轻微或者明显变暗，鲸部苍白，有时可见骨髓肌震颤，病鱼捞出水时，可见腹水从虹门中自动流出。4 SC/T 7224-2017 附录B(资料性附录)LA岛。引物设计及其在SVCV基因组中的位置B.1 LA岛IP引物设计示意

12、图见图B.l。F3 F2 F1=F3c F2c F1c sVCV-F3 primer 15-3 盯咱翩翩3|SVCV-F叫mi 5Rcn TargetDNA B23P5|SVCV四|B2,3翻.5rSVCV-B3阳unerB1c B2c B3c=B1 B2 B3 图B.1 LAMP 51物设计示意图B.2 L灿IP引物在SVCV基因组中的位置5-ATGTCTACTCTAAGAAAGCTCTTTGGAATCAAGAAGTCAAAAGGTACTCCTCCCACTTACGAGGAGACACTGG 3-TACAGATGAGATTCTTTCGAGAAACCTTAGTTCTTCAGTTTTCCATGAGG

13、AGGGTGAATGCTCCTCTGTGACC 5-CGACTGCACCAGTATTAATGGATACTCATGATACTCATTCCCACTCACTGCAGTGGATGAGGTACCATGTTGA 3-GCTGACGTGGTCATAATTACCTATGAGTACTATGAGTAAGGGTGAGTGACGTCACCTACTCCATGGTACAACT SVCV-F、VCV-FT、5-ATTGGATATACAATTGGACACCCCCTTGAAGACGATGTCAGACCTTCTCGGACTCTTGAAAAATTGGGATGTA 3-TAACCTATATGTTAACCTGTGGGGGAACTTCT

14、GCTACAGTCTGGAAGAGCCTGAGAACTTTTTAACCCTACAT sVCV-Blc adaptor Blc 5-GATTACAAAGGTTCTAGGAACAAGCGTAGATTctrACAGATTGATCATGTTCCGTTGTQcGTTAGAACTCAAGC 3-C鸣AATGTTTCCAAGATCCTTGTTCGTCTAAGATGTCTAACTAGTACAAGGCAACACGCAATCTTGAGTTCGFlc SVCV-Flc adap臼r5-ATGTGTCGGGAACATACTCTGTTGACGGGTCGGCCTTGTATTCCAACAAGGTGCAAGGAAGTTGTT

15、ATGTACC 3-TACACAGCCCTTGTATGAGACAACTGCCCAGCCGGAACATAAGGTTGITCCACGTTCCTTCAACAATACATGG、SVC职.B、SVCV-B5-TCATCGATTTGGTCAAATGCCTCCTTTCAAGAGAGAGATCGAGGTCTTTAGATACCCAGTACACCAACATGGA 3-AGTAGCTAAACCAGTTTACGGAGGAAAGTTCTCTCTCTAGCTCCAGAAATCTATGGGTCATGTGGTTGTACCT 5-TACAACGGGGTAGTAGATCTAAGAATGTCGATCTGTGATCTAAATGGAG

16、AGAAGACAGGCCTCAACCTGTTGA 3-ATGTTGCCCCATCATCTAGATTCTTACAGCTAGACACTAGATTTACCTCTCTTCTGTCCGGAGTTGGACAACT 5-AAGAGTGTCAGGTGGCTCACCCCAACCATTTCCAAAAATATCTAGAGGAGGTCGGGCTGGAGGCAGCCTGTTC 3-TTCTCACAGTCCACCGAGTGGGGTTGGTAAAGGTTTTTATAGATCTCCTCCAGCCCGACCTCCGTCGGACAAG 5-GGCCACAGGAGAGTGGATTCTTGATTGGACATTTCCTATGCCAGT

17、AGACGTGGTGCCTCGTGTTCCTTCCCTG 3-CCGGTGTCCTCTCACCTAAGAACTAACCTGTAAAGGATACGGTCATCTGCACCACGGAGCACAAGGAAGGGAC 5-TTCATGAGAGATTAA 3-AAGTACTCTCTAATT 5 SC/T 7224-2017 C.1 DEPC7./附录C(规范性附录)试剂配制每升去离子水中加人1mLDEPC，用力摇匀，使DEPC充分混匀在水中，3rc放置12h，然后1210C高压灭菌15min后备用。C.2 磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)每升去离子水中加入NaCl8 g、KCl0.2 g、NaHC03

18、1.15 g、KH2P040.2 g，经1210C高压灭菌15mm后备用。C.3 甜菜碱(5mol/L)称取2.93g甜菜碱(相对分子质量117.15)粉未，用5mL DEPC水溶解完全，再用直径为O.22m 的一次性滤器过滤分装至离心管中，一200C保存备用。C.4 显色液10 000 X SYBR Green 1荧光染料用DEPC水稀释10倍后备用，-20oC保存。6 SC/T 7224-2017 中华人民共和国水产行业标准鲤春病毒血症病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法SC/T 7224-2017 争等9导*中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销关*争6开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张O.75 字数15千字2017年9月第1版2017年9月北京第1次印刷书号16109 4218 定价18.00元版权专有僵权必究举报电话(010)65005894