SN∕T 3558-2013 马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法(出入境检验检疫).pdf

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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 马尔堡病毒犚 犜 犘 犆 犚和实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测方法犚 犜 犘 犆 犚犪 狀 犱狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲犚 犜 犘 犆 犚犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱 狊狅 犳犕 犪 狉 犫 狌 狉 犵狏 犻 狉 狌 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国科学院武汉病毒研究所。本标准主要起草人：洪烨、师永霞、袁志明、郑夔、相大鹏、黄弋、李小波、黄吉城、幸芦

2、琴、郭波旋、钟玉清、李燕。犛 犖犜 马尔堡病毒犚 犜 犘 犆 犚和实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测方法范围本标准规定了国境口岸马尔堡出血热检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，马尔堡病毒 检测和实时荧光 检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员携带马尔堡病毒的分子生物学检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫生部）缩略语下列缩略语适用于本文件。：反转录聚合酶链反应实时荧光 ：实时荧光反转录聚合酶

3、链反应 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数：核糖核酸：荧光染料，一种荧光报告基团术语和定义下列术语和定义适用于本文件。马尔堡出血热犕 犪 狉 犫 狌 狉 犵犺 犲 犿 狅 狉 狉 犺 犪 犵 犻 犮 犳 犲 狏 犲 狉；犕犎 犉由马尔堡病毒（）引起的、以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病，经密切接触传播，传染性强，病死率高。由于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行，又被称为青猴病和非洲出血热。马尔堡病毒犕 犪 狉 犫 狌 狉 犵狏 犻 狉 狌 狊属丝状病毒科，病毒基因组为单股负链，长约 ，编码种病毒蛋白，包括蛋白（）、病毒蛋白（）、病毒蛋白（）、病毒蛋白（

4、）、糖蛋白（）、依赖的 聚合酶主要成分糖蛋白（）和次要成分病毒蛋白（）。生物安全要求按照 和 人间传染的病原微生物名录 的要求，马尔堡病毒相关材料的生物安全要求犛 犖犜 如下：马尔堡病毒相关的病毒培养和动物感染实验操作应在生物安全级（或 ）实验室内进行；马尔堡病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全级（）实验室内进行；马尔堡病毒相关的灭活材料的操作应在生物安全级（）实验室内进行；马尔堡病毒感染材料的运输包装分类为类，编号为 。人体血清标本的采集、运输和保存无菌采集疑似病例发病天内静脉血 ，室温静置 使其凝固，犵离心 ，收集血清于无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验

5、室检测。如 内不能送到实验室，将血清置于 保存。血清标本的处理血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如 不能及时检测应存放在 冰箱。马尔堡病毒的犚 犜 犘 犆 犚检测 主要仪器本方法使用的主要仪器如下：扩增仪；千分之一天平；超净工作台；级生物安全柜；高压灭菌锅；低温高速离心机：最大离心力 犵；电泳仪；凝胶成像分析系统；旋涡振荡器；冰箱：、和；移液器：、和；恒温水浴锅。主要试剂除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用美国 公司 ）提取病毒核酸；试剂：美国 公司 ）；）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产

6、品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。无 酶的 水；犛 犖犜 检测的引物：上游引物 （）和下游引物 （），预期扩增片段为 ；电泳缓冲液（）：称取 碱，溶于 的重蒸水中，加入 （）、冰乙酸，至充分溶解后用水定容至，室温储存；使用前用重蒸水稀释至 进行倒胶和 电泳。溴化乙锭（）：在 水中加入溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。使用浓度为 。检测步骤 核酸提取 吸取 血清样本加入溶解的 裂解液。脉冲混匀，置于室温 。短暂离心，加入 乙醇（）脉冲混匀。短暂离心。将 旋转柱置于 收集管中。吸取 中溶液 转移至旋转柱上，犵离心 ，将旋转柱放至干净的收

7、集管上，丢弃包含过滤液的收集管。打开旋转柱盖，重复 。打开旋转柱盖，加入 洗液，盖紧盖子，犵离心 。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。打开旋转柱盖，加入 洗液，盖紧盖子，犵离心 。将旋转柱放至干净的收集管上，犵再离心 。将旋转柱放至干净的 离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。打开旋转柱盖，加入 室温平衡的缓冲液。盖紧盖子，室温放置 。犵离心 。收集滤出液，用于 扩增。或 储存。犚 犜 犘 犆 犚检测 准备 反应液，设 反应体系，每个待检标本反应液的组成为：缓冲液，无 酶的 水，模板。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据马尔堡病毒核苷酸序列体外转录的 片段；阴性对照模板

8、为不含马尔堡病毒核酸的标本或无 酶的水。将 反应管置于 扩增仪上进行操作，反应程序为：逆转录 ，预变性 ；变性 ，复性 ，延伸，个循环；延伸 ：。凝胶电泳扩增结束后，在扩增产物中加入 上样缓冲液，用含 溴化乙锭的 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统照相记录结果。结果判断 质量控制反应结果应同时符合以下个条件：犛 犖犜 阴性对照未出现特异性条带；阳性对照出现预期 大小的扩增条带。结果分析在实验结果有效情况下，如待测样品出现预期 大小的扩增条带，则可判断待测样品马尔堡病毒核酸 阳性，判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认；如待测样品中未出现预期大小的扩增产物，则可判断待测样品

9、马尔堡病毒核酸 阴性。测序对于首发病例，应将 扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成。使用 分析其与已公布的马尔堡病毒序列的同源性，判断扩增产物是否为马尔堡病毒核酸。实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测 主要仪器本方法使用的主要仪器如下：荧光定量 仪；超净工作台；级生物安全柜；高压灭菌锅；低温高速离心机：最大离心力 犵；旋涡振荡器；冰箱：、和；移液器：、和。主要试剂本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用美国 公司 ）提取病毒核酸；实时荧光 通用试剂：，美国 公司产品）；，美国 公司产品）；无 酶的 水；引物和探针：引物和探针序列见表。）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示

10、对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。犛 犖犜 表马尔堡病毒实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测的引物和探针引物探针名称序列（）扩增片段 基因片段，预期扩增片段为 基因片段，预期扩增片段为 注：等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。为犜 犪 狇 探针，探针序列中前面带“”号的碱基表示 修饰碱基。核酸提取见 。实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测 靶目标为犌 犘基因的实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测 加样使用 进行体系配置，设 反应体系，每个待检标本反应液的组成为：缓冲液、模板 。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据马尔堡病毒核苷酸序列体外转录的 片段

11、，阴性对照模板为不含马尔堡病毒核酸的标本或无 酶的水。实时荧光犚 犜 犘 犆 犚扩增反应在不同的荧光定量 仪上，犜 犪 狇 探针实时荧光 的反应条件略有不同。以 或 荧光定量 仪为例，实时荧光 检测扩增程序为：，；，（收集荧光信号），个循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。靶目标为犖 犘基因的实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测 加样使用 进行体系配置，设 反应体系，每个待检标本反应液的组成为：缓冲液、模板、重蒸水 。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据马尔堡病毒核苷酸序列体外转录的 片段，阴性对照模板为不含马尔堡病毒核酸的标本或无 酶的水。实时荧光犚 犜 犘 犆

12、犚扩增反应在不同的荧光定量 仪上，犜 犪 狇 探针实时荧光 的反应条件略有不同。以 犛 犖犜 或 为例，实时荧光 检测扩增程序为：，；，（收集荧光信号），个循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。结果分析 阈值确定阈值确定的方法对所有的样品都是统一的，一般是以荧光 反应的前个 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的 倍作为荧光阈值，以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（值）。质量控制反应结果应同时符合以下个条件：阴性对照无扩增曲线；阳性对照 值 并有明显扩增曲线。结果判定 根据以下条件进行结果判定：无明显扩增曲线，判断为马尔堡病毒荧

13、光 检测阴性；有明显扩增曲线，且 值，初步判断为马尔堡病毒荧光 检测阳性；有明显扩增曲线，且 值 的标本应重做，重做后只要出现扩增曲线，则判断为马尔堡病毒荧光 检测阳性，否则为阴性。阳性标本的确认：荧光 结果阳性的标本可进一步进行 扩增。对于首发病例，应对扩增片断进行测序和序列比对，确认是否为马尔堡病毒核酸阳性。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马尔堡病毒犚 犜 犘 犆 犚和实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元