NY∕T 3073-2017 家畜魏氏梭菌病诊断技术(农业).pdf

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1、ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3073一2017家畜魏氏梭菌病诊断技术Diagnostic techniques for c/ostridium welchii disease of Iivestock 2017-06-12发布2017-10-01实施付中华人民共和国农业部发布NY/T 3073-2017 目U吕本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:山东农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、青岛康大集团公司。本标准主要起草人:柴同杰、

2、李卫华、郭梦娇、蔡玉梅、韦良孟、王海荣、马连营、李明勇、刘曼。I NY/T 3073-2017 家畜魏氏梭菌病诊断技术1 范围本标准规定了家畜魏氏梭菌病的诊断技术。本标准适用于家畜魏氏梭菌病的临床诊断、实验室诊断、检验检疫、监测及流行病学调查等。2 临床诊断2.1 牛魏氏梭菌病2.1.1 牛魏氏梭菌病主要由D型、E型产气英膜梭菌感染引起。2.1.2 不同年龄、不同品种的牛(黄牛、奶牛、水牛等)均可感染发病，且四季均可发生。发病黄牛、棋牛多为体格强壮、瞟情较好者，奶牛多为高产牛。病程长短不一，短则数分钟至数小时，长则3d4 d或更长;有的呈跳跃式发生。2.1.3 临床表现为突然不安、呼吸困难。最

3、急性型病例无任何前驱症状，倒地死亡，有的在使役中或使役后突然死亡。2.1.4 急性型病牛体温升高或正常，呼吸急促，精神沉郁或狂躁不安，全身肌肉震颤、抽擂，行走不稳，口流白沫，最后倒地而死。2.1.5 亚急性型呈阵发性不安，发作时两耳竖直，两眼圆睁，表现出高度的精神紧张，后转为安静，如此周期性反复发作，最终死亡。2.1.6 急性和亚急性病牛有的发生腹泻，虹门排出含有多量黠液、色呈酱红色并带有血腥异臭的粪便，有的排粪呈喷射状水样。2.1.7 病理变化以全身实质器官出血和小肠出血为主要特征，肠道服气。2.2 羊魏氏梭菌病2.2.1 羊魏氏梭菌病主要由D型、B型产气英膜梭菌感染引起。2.2.2 不同品

4、种(小尾寒羊、黑山羊、奶山羊、绵羊、卡拉库尔羊等)、不同年龄的羊均可感染发病，一年四季均可发生，但以春秋多发，尤其是天气骤变、气温突然下降时。2.2.3 一般都是急性发作，病羊磨牙流涎，排带蒙古液粪便，有的为黠液性黑色混血稀粪。死后不久，腹部迅速膨大，口鼻常有白色或带血泡沫流出。2.2.4 病理变化为整个肠道黠膜充血，特别是小肠充血、出血、黠膜脱落;胃黠膜脱落，有出血性炎症;肾变软(肾廉烂)，稍加触压即溃烂，水冲洗后，肾表面呈绒毛状。2.3 猪魏氏梭菌病2.3.1 猪魏氏梭菌病主要由A型、C型产气英膜梭菌感染引起，称猪梭菌性肠炎、猪传染性坏死性肠炎、仔猪红摘等。2.3.2 该病病程短，死亡快，

5、死亡率高，一旦流行会导致大批仔猪死亡，但年龄稍大的猪造成死亡的少见。2.3.3 主要临床症状为腹泻、粪便呈红褐色，粪便有腥臭味。2.3.4 病理变化为肠站膜及蒙古膜下层广泛出血，肠壁呈深红色、部分肠段服气。肠壁变得薄而透明，空肠与回肠充满胶冻状液体。盲肠内有稀粪且有恶臭气体，胃黠膜脱落。2.4 家兔魏氏梭菌病1 NY/T 3073-2017 2.4.1 家兔魏氏梭菌病主要由A型产气英膜梭菌感染引起。2.4.2 一年四季均可发生，但春季和由秋向冬季转变过程中、气温骤降时多发。各种年龄均可发病，断奶幼兔发病率与死亡率较高。病兔在水泻的当天或次日即死亡，多为急性死亡。2.4.3 以急性腹泻，排黑色水

6、样或带血胶冻样粪便。脏门周围、后肢及尾部被毛被稀粪污染。抓起病兔摇晃躯体有泼水音。2.4.4 病理变化为胃底霜膜脱落，并有大小不等的黑色溃殇，肠勃膜呈弥漫性充血或出血，小肠充有气体，肠壁变薄，盲肠和结肠内充满气体和黑绿色稀粪便，有腐败臭味，膀脱积有茶色尿液。-噩雪哩!I.fta2.5 结果判定根据动物表现出的上述临3 产气英膜梭菌的分离接种环取3观察菌落形态，将厌氧培养24h分臭味，菌落颜色由3.5 产气英膜梭菌纯培挑取疑似菌落，涂3.6 生化鉴定.对葡萄糖、麦芽糖、煎糖、果糖、乳糖、不糖圃圃防T、呵|喋试验、HzS试验、MR、还原性硝酸盐试验、明胶液化进行试验。把分离株菌液加人生化反应发酵管

7、中，庆氧培养24h，观察生化试验结果。3.1.1 仪器光学显微镜法见A.2)、3.2 涂片、采取清氏染色反应野中革兰元菌儿异MG有养勒后培时出氧翻眼/A#养3.7 牛乳培养基进行暴烈发酵试验该菌能使牛奶培养基暴烈发酵。3.8 结果判定TSC培养基上可疑菌落为黑(玄)色;血平板上可疑菌落双溶血环，平板从培养箱取出后，菌落颜色由灰褐变为绿色。生化反应是葡萄糖+、麦芽糖十、煎糖十、果糖一、乳糖+、木糖、甘露醇一、水杨昔一、呵|睐试验一、HzS试验+、MR+、还原性硝酸盐试验十、明胶液化+，以及牛奶培养基暴烈发酵的分离株可判定为产气英膜梭菌。4 产气英膜梭菌毒素基因的PCR检测4.1 材料准备4.1.

8、1 仪器NY/T 3073-2017 厌氧培养箱、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、数显恒温水浴锅、振荡器、离心机、高压灭菌锅。4.1.2 培养基和试剂血琼脂平板、增菌培养基、Taq酶、DNA模板、dNTPs、双蒸水。4.2 引物根据产气英膜梭菌4种主要毒素基因序列和国内外公开发表的引物序列合成通用引物(见表1)。基因，bp(a!pha)cpa(325)(beta)cpbCl96)E(epsi!on)etx(656)(iota)iap(446)4.3 DNA模板的制备4.3.1 增菌表1引物序列上游引物(5-3)下游引物(5-3)GCTAATGTTACTGCCG寸GACCTCTGATA

9、CATCGTGTAAG GCGAATATGCTGAATCATCTA GCAGGAACATTAGTATATCTTC GCGGTGATATCCATCTAl寸CCCACTTACI寸GTCCTACTAACACTACTCTCAGACAAGACAG c寸TCCTTCTA1寸ACTATACG将第3章分离鉴定的产气英膜梭菌接种于营养肉汤培养基中，430C庆氧培养12h。4.3.2 模极制备取增菌培养物于1mL离心管中，8000g离心1.5 min2 min，弃去上清，加人100LTE(配制方法见附录B中的B.1)混匀作为模板。4.4 PCR反应体系(25L)4.4.1 PCR反应体系10 X Taq buff

10、er(含Mg2+)dNTPs 上游和下游引物(10pmol/L)模板无菌双蒸水Taq DNA聚合酶4.4.2 对照2.5L 2.5L 各1L2L 15.75L O.25L 同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用B型(NCTC8533)、E型(NCTC8084)产气英膜梭菌标准菌株的菌体做阳性对照，用大肠杆菌标准菌株的菌体做阴性对照，用无菌双蒸水做空白对照。4.5 PCR反应940C变性5min，然后30个循环，分别为:940C变性30s;530C退火30s;720C延伸1mino最后720C延伸10min，40C保存。4.6 电泳用TAE(配制方法见B.2)制备1%琼脂糖凝胶，加样6L8L，

11、在电压80V100 V、电流40mA下进行电泳30min40 min。4.7 结果判定用凝胶成像仪观察扩增条带，在阴性对照和空白对照泳道无条带，阳性对照泳道出现325bp、日196NY/T 3073-2017 bp、.:656bp、446bp的清晰条带的条件下，根据阳性条带大小判断样品阳性或者阴性(参见附录c)。5 产气英膜梭菌毒素型的ELISA鉴定5.1 仪器、材料准备5.1.1 仪器酶标仪、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、庆氧培养箱、恒温箱、96孔高吸附性酶标板、洗瓶或者洗板机。5.1.2 培养基和试剂5.2.1 检测样品5.2.1.1 复苏将第35.4 ELISA检测毒素5.4.1

12、包被抗体将适量稀释的标准血8.C静置12 h)。5.4.2 冲洗、抗D-酶标抗体、包被液D.3)、封闭液(配制方法见，一20.C抗c-板和抗D-板包被液甩掉，用PBST缓冲液再加满，重复5次，然后在纤维纸上轻扣，将孔隙中剩余水洗液彻底除掉。5.4.3 封闭每孔200L封闭液，3 7C温浴3h(或4.C8.C静置12h)，封闭后的微量反应板可在20.C下长时间保存。5.4.4 样晶稀释用PBS将毒素稀释为2.0%2.5%06L样品十784LPBS或20L样品+780LPBS)。5.4.5 样晶中和NY/T 3073-2017 用抗C血清和抗0-血清包被的反应板的A+B孔各加入100L样品稀释液(

13、5.4.4)(每个样品稀释液总量为800L)。将每个样品稀释液剩余的600L(用于抗c-板的)加人抗0-血清(异系中和)，再各取100L分别加入c+o孔中。其次400L加8L抗C血清(同系或全部中和)，同样各取100L加人E十F孔中。用于抗0-血清板的每个样品毒素的异系中和及同系中和分别采用9L抗C一血清和4L抗D一血清，其他步骤同抗C-板。20s振摇(250次/min)后用铝纸罩好，在室温下1h放置，然后同上水洗。5.4.6 加酶标抗体抗C-板与抗0-板分别加入稀释的(1:400)抗C-酶标抗体与抗0-酶标抗体。酶标抗体须在使用前30min稀释配制。两个反应板30s振摇，1h室温下放置，然后

14、同上水洗。5.4.7 加底物每孔加100L底物显色液，室温下反应35min。5.4.8 终止每孔加50L终止液终止反应。5.4.9 读板使用酶联免疫检测仪测定各孔在405nm处的00值。在同一板上同时设有标准阳性对照和标准阴性对照。反应板在测量前再一次振摇。5.4.10 评定输入相应软件的计算机与酶联免疫检测仪相连，自动对每个菌株测试结果(阳性、阴性或可疑)做出判断。根据阳性对照和阴性对照的00平均值来计算，首先是标准C、D菌株在抗C板和抗D板阳性值。异系中和(C十0)/200值一全部中和CE+F)/200值=毒素00值。超过cut-off10%的值作为阳性，低于cut-off10%的为阴性。

15、在其之间是可疑，这样的菌株从毒素制取到ELISA必须重做。抗C-板中C型CWeybridgeNCTC 3180)为阳性C+)、D型(WeybridgeNCTC 8504)为阴性(一),抗0-板中C型CWeybridgeNCTC 3180)为阴性(一)、D型CWeybridgeNCTC 8504)为阳性C+)，该试验成立。5.5 结果判定见表2。抗c-板+表2产气英膜梭菌毒素型的判断抗D-板十+6 疑似患病动物的肠内容物及血清中产气英膜梭菌毒素的ELISA检测方法6.1 材料准备6.1.1 仪器型别B C D A 酶标仪、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、厌氧培养箱、恒温箱、96孔高吸附性酶标

16、板、洗瓶或洗板机。6.1.2 材料抗毒素多克隆抗体(制备方法见附录E中的E.l)、抗毒素单克隆抗体(制备方法见E.2)。6.1.3 样品处理5 NY/T 3073-2017 无菌取病变明显动物的肠内容物，用灭菌生理盐水进行1:1稀释后，40C、3000g，离心30min，取上清液，再以40C、8000g，离心15min，取上清。无菌取疑似患病动物的血液，3000g经过40C，15 min离心，取上清。6.2 双抗体夹心ELISA的基本操作程序6.2.1 包被抗体用0.1mol/L碳酸盐缓冲液稀释纯化的多抗3L/mL包被酶标板，100L/孔40C过夜。6.2.2 冲洗PBST洗3次，每次4min

17、。6.2.3 封闭每孔200L封闭液，6.2.4 加入样品PBST洗3次，每o运量圃，正向羽曲，们孵育1h后，PBST洗板。6.2.5 单克每孔加人36.2.6二6.2.7 显色每孔加6.2.8 终止加入终6.3 结果阴性对阳性对照样品检测检测阴性对值。OD450run介于7 产气英膜梭菌7.1 仪器材料准备7.1.1 仪器超净工作台、高压灭菌锅、离7.1.2 材料产气英膜梭菌毒素金标试纸条(制备方法见附录F)。7.2 检测方法、阳性的临界取病变明显的死亡动物的回肠内容物，用灭菌生理盐水进行1:1稀释后，40C、3000g，离心30min取上清液，再以40C、8000g，离心15min，取上清

18、液100L，将试纸条样品垫插入其中，液面不浸过金标垫。取出后水平放置，10min后观测结果。7.3 结果判定阴性对照检测线处不出现红色条带，质控线处出现红色条带的条件下，该试验成立。样品中存在毒素，检测线处产生红色的条带，质控线处同样出现红色条带，判定为阳性结果才日果6 NY/T 3073-2017 被检样品中不含有毒素，则检测线处不出现红色条带，只在质控线处出现红色条带，判定为阴性结果。8 综合判定在2.5、3.8和4.7阳性结果的基础上，加上6.3或7.3中任何一项阳性者，均判定为魏氏梭菌病。其诊断适用范围见附录Go采用相关疫苗免疫接种的家畜发病，应综合分析原因。7 NY/T 3073-2

19、017 附录A(规范性附录)培养基的配制A.1 TSC平板TSC培养基47.0 g 0.5%D-环丝氨酸溶液80mL TSC培养基加热溶解于1000mL蒸馆水中，1210C高压灭菌15min。冷至500C时，加入过滤除菌的0.5%D环丝氨酸溶液80mL，倾倒平皿。A.2 血琼脂平板血琼脂基础培养基40.0g、葡萄糖10g，加热溶解于1000mL蒸馆水中，1160C、30min灭菌，冷至450C500C时，加人5%的元菌脱纤维公绵羊血，混匀，倾人无菌平皿。A.3 增菌培养基营养肉汤培养基33.0g，溶解于1000mL蒸懵水中，1160C、30min灭菌。A.4 产毒培养基蛋白陈20 g L-精氨

20、酸12 g 酵母浸粉20 g 糊精10 g 加热溶解于1000mL PBS缓冲液中，调整pH为7.4后，1160C、30min灭菌。8 B.1 四缓冲液(pH7.6)配制B.2 Tris碱Na2EDTA.2H20 NaCl 双蒸水待上述混合物50XTAE 三是甲乙二胶双蒸水待应用前，用NY/T 3073-2017 附录B(规范性附录)PCR反应溶液的配制室温保存。9 NY/T 3073-2017 附录C(资料性附录)PCR检测鉴定结果毒素基因PCR检测结果见图C.L10 说明:M-2 OOOMarker;2000 1000 750 5 250 100 l-A型标准株NCTC528();2-一分

21、离株1;3-一分离株2;4一一分离株3;5-一分离株4;M 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 6一一空白对照，7一一阴性对照;8一-A型阳性对照);9一-C型阳性对照(、);10-E型阳性对照(、);11一一D型阳性对照(、)。图C.l毒素基因PCR检测结果附录D(规范性附录)酶联免疲服附试验溶液的配制D.1 包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6)Na2C03 NaHC03 ddH20加至1000?、aClKCl NaCl KCl Na2 Tween-D.4 封闭液含1%小牛血清的0.D.6 底物显色液D.6.1 底物缓冲液O.2 mol/L Na2 HP04 0.1 mol/L拧棱酸加

22、ddH2050 mL补充至100mL。D.6.2 TMB工作液TMB(l mg/mL)底物缓冲液30%H202 10L。25.7 mL 24.3 mL 1mL 9mL NY/T 3073-2017 11 NYjT 3073-2017 D.7 终止液(2moI/L H2S04)量取108.7mL的浓硫酸，缓慢加入到600mL的去离子水中，不断地搅拌，冷却至室温时，加入去离子水补充至1L。12 NY/T 3073-2017 附录E(规范性附录)酶联免疫吸附试验单抗和多抗的制备E.1 抗毒素多克隆抗体制备自动液相色谱分离层析仪提纯毒素蛋白，取2mL与等量弗氏完全佐剂乳化，1mg/只颈背部皮下多点注射

23、免疫2kg3峙的新西兰大白兔。间隔2周后二免，注射剂量与方法同上。2周后，同种方法进行三免。三免后2周用无佐剂抗原加强免疫，15d后心脏采血获得血清，饱和硫酸锻沉淀法纯化获得的多克隆抗体。E.2 抗毒素单克隆抗体制备提纯毒素蛋白，与等体积弗氏完全佐剂完全乳化后，100g/只腹腔注射进行三次免疫6周龄8周龄与骨髓瘤细胞SP2/0同源的雌性BALB/c小鼠。三免后2周，小鼠尾部采血利用间接ELISA检测血清抗体效价，3周后腹腔注射不加佐剂的重组毒素蛋白作为加强免疫，3d5 d取效价最高小鼠脾细胞与生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0利用PEG1500进行化学法融合，将阳性单克隆细胞株扩大培养注人弗氏

24、完全佐剂提前致敏的小鼠腹腔，制备单克隆抗体腹水，经正辛酸一硫酸镀方法纯化得到抗毒素单克隆抗体。l3 NY/T 3073-2017 附录F(规范性附录)产气英膜梭菌毒素金标抗体及试纸条的制备F.1 肢体金标记物的制备按拧棱酸三铀还原法制备胶体金溶液。将98mL双蒸水加热至650C，磁力搅拌下准确加入新鲜制备的1%的氯金酸水溶液1mL，继续加热至950C，迅速加入1%橡酸三铀水溶液1mL，不断搅拌煮沸15mln，待溶液颜色由黑蓝紫变成酒红色时，停止加热，冷却至室温，40C保存备用。F.2 金标抗体的制备及喷涂分别取相应量的肢体金和产气英膜梭菌毒素多克隆抗体，在不停搅拌条件下将胶体金溶液和抗体混合，

25、10min后再加100 g/L的BSA使其最终质量浓度为10g/L，4C封闭30min,12000 g离心30mlno仔细吸除上清液，沉淀物用含10g/L BSA的0.01moL/L pH 7.2的PBS溶液重悬至原体积，重复离心1次，最后用PBS将沉淀物混悬为原体积的1/10，40C避光保存。裁取10mmX4 mm的玻璃纤维，取1mL的金标抗体喷涂于玻璃纤维上，37C干燥1ho 14 魏氏梭菌病诊断的适用范围见表G.L附录G规范性附录)诊断适用范围表G.l魏氏梭菌病诊断的适用范围现场诊断实验室诊断2临床诊断3产气英膜梭菌分离、鉴定6产气英膜梭菌毒素的ELISA检测方法4产气英膜梭菌毒素基因的

26、PCR检测7胶体金产气英膜梭菌毒素的胶体金试剂条6产气英膜梭菌毒素的ELISA检测方检测方法法NY/T 3073-2017 细菌毒素型的鉴定5产气英膜梭菌毒素型的ELISA鉴定15 NY 中华人民共和国农业行业标准家畜魏氏梭菌病诊断技术NY/T 3073-2017 争等兴*中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址.ccap.COT)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销9号争毛争等开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张1.25 字数25千字2017年9月第1版2017年9月北京第1次印刷书号16109 4211 定价30.00元版权专有僵权必究举报电话(010)65005894