SN∕T 2367-2009 进出境植物种子种传病原检测操作规程(出入境检验检疫).pdf

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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出境植物种子种传病原检测操作规程犘 狉 狅 犮 犲 犱 狌 狉 犲 狊 犳 狅 狉 狋 犺 犲犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳 狊 犲 犲 犱 狋 狉 犪 狀 狊 犿 犻 狋 狋 犲 犱狆 犪 狋 犺 狅 犵 犲 狀 狊犻 狀犻 犿 狆 狅 狉 狋 犻 狀 犵犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 犻 狀 犵狊 犲 犲 犱 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书目次前言范围规范性引用文件术语和定义原理主要仪器设备与试剂准备工作现场检查与取样直接检查植物病原真菌 植物病原细菌 植物病毒 植物病原线虫 样品保存附录（

2、资料性附录）主要种传病原真菌及其检验方法 附录（资料性附录）主要种传病原细菌及其寄主 附录（资料性附录）主要种传病毒及其寄主 附录（资料性附录）主要种传病原线虫及其寄主 附录（资料性附录）主要试剂及配制方法 附录（资料性附录）主要培养基及配制方法 附录（资料性附录）血清学检测方法 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 附录（资料性附录）分子生物学检测方法 附录（资料性附录）致病性测定方法 附录（资料性附录）指示植物 犛 犖犜 前言本标准的附录、附录、附录、附录、附录、附录、附录、附录、附录和附录均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫

3、局。本标准主要起草人：林石明、廖富荣、余芳平、陈青、陈红运、王宏毅、吴媛。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出境植物种子种传病原检测操作规程范围本标准规定了植物种子传播的病原真菌、细菌、病毒（包括类病毒）和线虫等病原微生物的检疫鉴定的程序和一般方法。本标准适用于植物学概念的真种子和作为繁殖材料的果实（如：颖果、瘦果、核果、坚果等）；不适用于植物营养器官的块根、块茎、鳞球茎、地下或地上茎、以及嫩枝和吸收枝等农业概念的“种子”，以及人工、人造种子。经过化学或物理处理的种子（如种衣剂处理）可以参照本标准。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期

4、的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。小麦矮腥黑穗病菌检疫鉴定方法植物检疫手册（国家质量监督检验检疫总局，）术语和定义 种子 狊 犲 犲 犱各类植物繁殖材料的总称，包括三个涵义，即：植物学概念的种子：由植物母株花器的胚珠发育而来的，经过雌雄配子的有性结合所产生，也称真种子；植物学概念的果实：由植物母株的子房壁或花器的其他部分发育而来的外果皮，也称为“子实”或“子粒”，如多数禾本科作物的颖果，向日葵的瘦果，菊科蔬菜作物的双悬果，甜菜的小坚果，果

5、树林木的坚果和核果等；作为繁殖材料的植物营养器官：如马铃薯的块茎，甘薯的块根，葱蒜类的鳞茎，慈姑的球茎，甘蔗的地上茎，杨柳的嫩枝，以及莲的吸收枝等。本标准所指种子为、所述。种传病原 狊 犲 犲 犱 狋 狉 犪 狀 狊 犿 犻 狋 狋 犲 犱狆 犪 狋 犺 狅 犵 犲 狀 狊附着或寄生于种子外部、内部，或混杂于种子中，以种子作为载体或媒介传播为害新生植物体，引起新生植物体局部或系统侵染病害的植物病原物。种传病原包括植物病原真菌、细菌、病毒（含类病毒）和线虫。（）试图将种子只是传带病原物而不会引起植物病害的一类病原物称为种带病害（），而将还会引起植物病害的称为种传病害（）。由于两者难于区分，本标准

6、统一采用种传病害。原理 病原真菌 以病菌的子实体或病组织混杂在种子中间，如小麦、大麦和黑麦等禾本科种子中的黑粉菌菌瘿、犛 犖犜 麦角；水稻种子中稻曲病的菌核等。病原菌与种子一起休眠后萌发，进行局部或器官专化性侵染。子实体和病组织可以用肉眼检查。以繁殖体（无性或有性的孢子）或菌丝体附着在种子的表面，当种子萌发时进行局部或系统侵染。可以采用分离培养或洗涤方法进行检验。以菌丝体潜伏在种子的种皮或颖壳内或种皮与颖壳之间，随着种子的萌发而萌发，引起局部侵染或系统侵染。可以采用萌发、分离培养的方法进行检验。以菌丝体侵入种子的内部，特别是早期侵入，潜伏在种皮以内的组织中。肉眼可以观察到种子的表面的不同程度症

7、状；由于是内部感染，需要用分离培养或萌发的方法进行检验。以菌丝体潜伏在种胚内。在种子发育期间侵入种胚，并以休眠菌丝体的形式潜伏在种胚内。种子外表与正常的种子没有太大差别，播种后也会萌发，但是产生系统性侵染，如小麦的散黑粉菌。这类病害检验难度比较大，需要进行整胚检验或化学染色检验，或者试植检验。参见附录 开展种传病原真菌的检验。如需要，植物病原真菌进行分离、培养、纯化，根据形态学特征、生物学特性以及必要时的致病性测定等进行鉴定。病原细菌 细菌附着在种子表面。有些细菌在干燥条件下可以长期潜伏，保持休眠状态，随着种子萌发而侵染。细菌潜伏在种子内部。有些细菌通过维管束由胚座，或由种子的珠孔侵入种子内部

8、，潜伏在颖壳、胚乳或胚等，播种后扩散到维管束引起系统侵染。参见附录开展种传病原细菌的检测。如需要，植物病原细菌的检验进行分离、培养、纯化，主要是根据形态学特征、生物学特性、生理生化试验和必要时的致病性测定，以及血清学和分子生物学方法等进行检测鉴定。植物病毒（包括类病毒）种子外表传带病毒：病毒的颗粒污染种子的外表，如烟草花叶病毒。不同病毒的体外保毒期不同，有些可以长达近百年，有些只有几个星期。种胚外部传带病毒：如甘蔗花叶病毒。种胚内部传带病毒：种传病毒多数属于胚珠传染和花粉传染类型。种传病毒的带毒率和存活期，不同的病毒在不同的寄主植物、不同品种、不同生产季节和不同的产地等存在较大的差异。开展检测

9、过程中需要不断收集该方面的资料，总结分析检测结果。参见附录开展种传病毒的检测。植物病毒的检测鉴定主要采用生物学、血清学和分子生物学方法进行检测鉴定，以及电子显微镜的形态特征等。由于病毒在种子的分布情况与种植后小苗地发病情况具有较大的差异。有些虽然在种子的表皮污染有病毒的粒子，但是，在种子种植后并不能发病。为此，为了确定种传病毒的活性，需要选择正确的检测方法。植物病原线虫 附着于种子外表。线虫的幼虫或成虫附着在种子的外表，或存活在土块中，或产生虫瘿混杂在种子中。潜伏在种子内部。植物病原线虫的检验需要根据种子带线虫的方式，采用肉眼检查、过筛检验、比重检验和漏斗分离检验等，并主要根据形态特征进行种类

10、鉴定（参见附录）。主要仪器设备与试剂 仪器 离心机（台式离心机、冷冻离心机、高速离心机）；显微镜（；或带底光源的立体显微镜，）；犛 犖犜 培养箱（，带定时器，近紫外光或黑光灯光源）；冰箱（）；烘干箱；回旋式振荡器；天平；高压灭菌器；冰冻切片机；超净工作台；酶标仪；仪；电泳仪；凝胶成像系统；恒温水浴锅。器具和器皿 种子研磨器具（机）；手持扩大镜；移液器；培养皿（直径 ）；吸水纸或滤纸（直径 ）；筛网（孔径）。试剂染色剂、浮载剂、表面消毒剂及生化试剂等（参见附录）。参照物质植物病原真菌、细菌和植物病毒的检测鉴定，应采用参照菌株或其他适宜的阳性、阴性质控物。所采用的参照菌株或质控物应该是来自权威的机

11、构，并经过必要的验证。准备工作在接受任务之后，开始检疫前需要对种子的种类进行正确的判定。查询该寄主植物种传病害的种类、带菌（毒）率和存活期等相关资料（参见附录 至附录），以及相关的文献资料；尽可能查阅原产地的病害发生情况；确定检验方案（包括检测项目和检测方法等）。现场检查与取样仔细检查有无土块、病残体、虫瘿、菌瘿等真菌的子实体、杂草籽和害虫；有无发霉、腐烂、病斑、疱斑、肿块、开裂、变色、畸形或发育不正常的种子。注意分辨由于生理性原因（如：缺素、温度、湿度、甚至毒素等）所引起的异常种子的区别。重点抽取具有典型或有可疑症状的种子，或按种子千粒重随机扦取样品足够实验室检测所需要的种子数量。样品的扦取

12、比例见 植物检疫手册。进行简明而准确的描述和记录，必要时还应照相和（或）录像。直接检查 感官检验用低倍放大镜或直接肉眼检查外表有明显症状的种子、可见的病原物子实体。检查病残体、菌瘿、菌核和虫瘿等；种子有无发霉、腐烂、病斑、疱斑、肿块、开裂、变色、畸形或发育不正常等情况；种子中是否有害虫、土块、杂草籽等。犛 犖犜 过筛检验利用病原物与种子的形状、大小的区别，通过网筛将病原体筛出，再挑拣或放大镜检查。根据种子的大小，采用筛目不同的（）层套筛，进行旋转连续筛理数分钟（采用电动筛选器效果更好）。筛理后，将各层筛上的试样倒入白色瓷盘内，摊成薄层，放大镜或肉眼检查，挑拣出病原物的子实体。解剖检验如果检查到

13、病残体、虫瘿或菌瘿等组织结构，徒手切片或冰冻切片或石蜡切片，制片检查。必要时染色检查。记录形态特征，测量大小，并进行鉴定。种衣剂的处理经过种衣处理的种子由于抑制或掩盖目标菌的生长，影响检测结果。培养前需要用无菌水、酒精或其他的表面活性剂清洗种子表面的农药。采用以下的方法，如萌发培养或试植检验方法（见）。植物病原真菌 洗涤检验称取 或适量的种子，加无菌水 ，在振荡器中振荡 ，取洗涤液在 离心 ，弃上清液，加适量席尔氏液（其配制方法见 ）镜检沉淀物。本方法仅限于种子批数量相对较大的样品。对于具有典型形态特征的孢子、孢子梗等结构的病原真菌，可以采用此方法进行检验。胚胎计数法（或染色检验法）根据千粒重

14、，称取种子（如小麦种子 ，约 粒 粒），设个重复。将样品倒入新配置的 氢氧化钠溶液中，下放置，完全浸透后，再将样品倒入适宜容器中，用温水洗涤，从果皮下分离出胚芽。将所收集胚芽放在孔径的筛网内，用更大孔径的筛网收集胚乳和种皮碎片。把胚芽移入等量的甘油和水中，进一步分开胚芽和种皮。在通风厨中，把胚芽移到装有 新鲜无水乳酚油的烧杯中，煮沸乳酚油，在沸点下清洗。把胚芽转移到新鲜的微温甘油中。在带底光源解剖镜检查胚芽，可见到一些具有特征性的菌丝体（如小麦散黑粉菌为金褐色菌丝体，宽约，菌丝体占据整个盾片。如果细胞壁变色，它们可能被散黑粉菌感染）。本方法可以用于检验胚芽组织受到感染，如黑粉菌、内生菌等病害的

15、检验。在检验过程中应该注意感染胚芽的各类真菌的菌丝体的差别。萌发培养检验 吸水纸法每个培养皿铺三张吸水纸（根据培养皿的直径选择吸水纸，通常直径为 ；也可采取不同颜色的吸水纸以便观察），用无菌蒸馏水浸透，后倒去多余的水。在无菌条件下，根据种子的大小，每个培养皿均匀地摆放适量的种子（，或 粒，种子之间距离约 ）。培养皿在光管下约 处，不要重叠。在 恒温下（可根据种子和病原菌设计温度，如 ），光暗交替处理（交替）或黑暗条件下，保湿培养，解剖镜检查种子上真菌生长情况，高倍显微镜子实体并鉴定。检查培养物，观察子实体（分生孢子、分生孢子梗、分生孢子器、分生孢子盘等），记录侵染的部位、侵染百分率；菌落的密度

16、、颜色等，进行鉴定。必要时，还需采用适宜的培养基进行分离、纯化培养。以下方法是吸水纸法的改进。，吸水纸法：种子事先用 新鲜配置的，钠盐溶液浸泡处理，抑制种子萌发。其余方法同上。冷冻吸水纸法：培养 后，转移培养皿到冰箱 下培养。冰冻后，在 犛 犖犜 下，光暗交替或黑暗条件下培养。其余方法同上。琼脂平板法将种子浸泡在 的双氧水中 （份的双氧水与份的种子），期间搅拌种子次次。倒去双氧水，并加无菌水搅拌 。在无菌条件下，倒去无菌水，用无菌吸水纸吸干种子表面的水。检测带菌率则不进行表面消毒，直接用种子进行分离培养。无菌条件下，在水琼脂培养基或麦芽汁琼脂培养基培养皿上，均匀摆放种子。在 下，黑暗近紫外光交

17、替培养（培养皿在光管下约 处，不要重叠）。之后，用解剖镜下检查培养物，用高倍显微镜下检查分生孢子等子实体结构。每检查一次，将有变色污点的种子取出，记录侵染的部位、侵染百分率、菌落的形态、颜色等。必要时，还需纯化培养，或单孢子分离。其他培养基的制备方法参见附录。小苗症状检查 沙土培养法挑取异常的种子，播种于蒸热消毒过的营养土或细沙中，将种子按合适间隔地播种后，覆盖约 的基质，置于室温下（或，交替光照）。周后检查异常的幼苗，进行病原菌的分离；病毒检验则进行血清学试验（参见附录）和（或）分子生物学（参见附录）的方法进行检测和电镜检查。试管琼脂法对于比较小的种子，可以将种子播种于直径、内装 的水琼脂试

18、管中，每管种子粒或多粒，在（或适宜的温度）下培养，按 日光灯光照处理（为保持湿度，试管用铝箔覆盖）。当幼苗长出覆盖物时移出，进行病原菌的分离，病毒的血清学试验和（或）分子生物学的方法进行检测。鉴定 形态鉴定根据病原真菌的生长情况、培养的菌落特征、繁殖体的类型、大小进行鉴定。血清学鉴定使用检测鉴定试剂盒对植物病原真菌的种类（属或种）进行鉴定（参见附录）。分子生物学鉴定将所分离的病原真菌，设计特异性引物，并进行分子生物学检测鉴定（参见附录）。致病性测定致病性弱，具有致病性差异的生物型、型种或变种，以及生理小种的植物病原真菌的鉴定则需要进行致病性测定（参见附录）。结果判定具有典型特征性孢子等子实体结

19、构或载孢体结构的，可根据形态特征进行鉴定。无典型特征性形态特征的，结合形态特征、培养性状和致病性等，血清学和（或）分子生物学进行鉴定。植物病原细菌 样品制备根据种子的千粒重，称取检测所需的种子倒入新的、干净的塑料袋中。用研钵或在适宜的容器内粉碎，或用种子粉碎机粉碎。防止种子之间的交叉感染，应戴手套或用 酒精擦拭或喷洒消毒所有接触表面、容器、手等。接触样品和处理样品前均需消毒。检验方法 提取根据所检测的种子数量，每 粒种子，或粉碎的种子，将把灭菌的 无菌的生理盐水和吐温 溶液倒入烧瓶中，预冷处理 ，加入种子，悬浮。室温 下，在犛 犖犜 振荡器上以 振荡。配制十倍系列稀释液静置种子洗涤提取液，收集

20、上清液（母液）。无菌条件下，取 （或 ）母液加 （或 ）无菌生理盐水，配制成 的稀释液。按此方法，根据需要，配制、等十倍系列稀释液，并标记浓度。每次稀释前均需充分混均种子提取液或稀释液中。每次都应该使用新的吸头。稀释后应该最好在 内尽快使用；否则，应该保存在下保存备用。涂布培养培养基参见附录。从最高倍数（最低浓度）开始，依次吸取 种子提取液的稀释液和母液，加到表面干燥的选择性或半选择性培养皿上。用弯曲的无菌玻棒均匀涂布。在吸取过程中，每个培养皿应使用新吸头和玻棒。如果是从最低浓度到最高浓度（没有稀释），一个吸头和一根玻棒就够了。待到培养基完全吸收稀释液后，将培养皿倒扣过来。如有必要，可在生物安

21、全柜或超净工作台用无菌气流吹干。在 下培养，后观察平板。质控物需要设置阳性和阴性对照（参照菌株），以及无菌对照（无菌生理盐水和吐温 溶液。其稀释和培养方法同上。参照菌株的稀释倍数约为 。每个处理至少设置个重复。检查平板检查阳性对照和无菌对照。与典型的参照菌株的菌落比较，检查是否有相似的可疑菌落。如果没有，则再培养 即可；如果有，则用 培养基进行划区纯化培养。计算可疑菌落和其他菌落的数目。纯化与鉴定用记号笔在培养皿底部划线，从中心起分为个区。取单个菌落“之”字形划线纯化。每个菌株间预留足够空间，以防菌落融合在一起。为了避免菌株间的交叉污染，每个菌落都要用新区，每个检测样最少需要纯化个菌落。在 下

22、培养 ，记录每个菌落的情况。如果怀疑菌落不纯，需要再次划线纯化。与参照菌株比较，挑取可疑菌落在 培养基培养繁殖，以备作致病性测定和其他鉴定之用。鉴定 细菌自动鉴定仪的鉴定自动鉴定系统按原理分为基于微生物的表型分析或微生物的基因型检测。分离纯化的菌落，设置阴性和阳性质控物，按照所使用的“仪器操作说明”进行种类鉴定。血清学检测鉴定使用检测鉴定试剂盒对植物病原细菌的种（或属）进行鉴定（参见附录）。分子生物学检测鉴定将所分离的病原细菌，设计特异性引物，并进行分子生物学检测鉴定（参见附录）。致病性测定植物病原细菌的致病性测定主要是针对那些致病性比较弱，又有多种生理生化分化的生物型、型种或变种，以及生理小

23、种的鉴定（参见附录）。结果判定根据在培养基上的菌落特征，致病性测定的结果，结合生理生化特性和或血清学特性和或分子生物学特性进行鉴定。关键控制点阳性对照或参照菌株所配制的稀释平板应能够产生具典型特征的单个菌落。犛 犖犜 稀释平板的菌落数量应与稀释倍数相一致（每级的稀释倍数约以十倍率减少）。无菌对照的稀释平板应该没有产生菌落。致病性测定都应设阳性或参照菌株对照，并且产生典型的症状。选择性或半选择性培养基中的抗生素的活性应该有质量保证。由于生产批号的不同而有变化，使用前应该进行必要的验证，并据此调节抗生素的浓度。植物病毒 样品制备 样品数量感染病毒的种子有时会表现外部异常症状，如种子变小或变大、不饱

24、满、皱缩、畸形；种子破裂、坏死，种皮变色等，但是多数情况下病种子看起来是正常的。不同植物种类的种子、病毒，传带病毒的几率相差很大；根据所传带的植物病毒种类，病毒传带比例和存活期等，确定所需要检测的种子量。对于种子传带病毒的比例较低的，检测的种子数量最少应有 粒（大粒与特大粒种子除外）；根据种子的大小将样品分成若干份检测样品，每份 粒 粒。种子提取将种子分成若干份，每份 粒 粒，放入适宜于研磨的容器中。按一定比例，在每份样品中加入 提取缓冲液（参见附录）中研磨，直到将种子粉碎均匀。研磨工具可以是研钵或研磨机。种子提取液用于接种指示植物（参见附录）、血清学检测（参见附录）或分子生物学检测鉴定（参见

25、附录）等。种子提取液应在内使用，否则应在下保存。小苗培育将种子经过加热保湿催芽或直接播种于小盆钵。培育至产生真叶，就可以进行生物学、血清学、分子生物学的检测等。应选择适宜的栽培介质，如采用砂、珍珠岩或土壤；栽培介质均需要高压灭菌处理。虽然多数的栽培介质可循环使用，但是经过一段时间之后，需要更换。组织提取称取幼嫩植物组织（叶片、嫩茎等），分成若干份，每份 ，放入适宜于研磨的容器中，加入适宜的提取缓冲液（参见附录），研磨或在榨汁机上榨汁。组织提取液用于接种指示植物（参见附录）、血清学检测（参见附录）或分子生物学检测鉴定（参见附录）等。检测方法 生物学方法 接种根据病毒的种类，选择适宜的指示植物（参

26、见附录）。选片片最新完全展开的叶片，轻轻地弹去叶片上灰尘。将金刚砂撒在叶片表面，用棉签蘸取种子提取液，轻轻地摩擦叶面。在接种的组织提取液中加入硅藻土进行接种。接种植物应培养于 的温室或生长箱中。接种后 内，用水轻轻冲洗叶片，避免伤害接种叶片。同样方法接种阳性（参照物质）和阴性对照（提取缓冲液），至少两株。诱导系统侵染接种植株在控制条件下（根据植物与所检测的病毒显症条件选择温度和光照）至少培育。电子显微镜检查样品用适宜的缓冲液中研磨、提取（见 ）。采用免疫电子显微镜进行观察。病毒抗体用 或犛 犖犜 缓冲液（）稀释 倍（不同种类和批次的抗体稀释倍数可能不同）。室温下，将表面盖有 膜的铜网在几滴病毒

27、抗体溶液（）中浸没 ；铜网用 滴 或 缓冲液冲洗，用滤纸吸干多余缓冲液（但不能过分干燥）；铜网在植物提取液（）中浸没 以上（病毒浓度低则需）；用 或 缓冲液冲洗铜网，吸干多余缓冲液；在病毒抗血清溶液（用磷酸缓冲液 稀释 抗血清）中再浸没 ；用蒸馏水清洗铜网后加乙酸铀酰染色，在万倍透射电镜下检查。鉴定 生物学方法参照所检测的病毒在寄主植物和指示植物上所引起的典型症状，检查接种植物的症状。初步判定所检测到的病毒种类。形态特征根据电子显微镜所观察到的病毒粒子形态，对照病毒的典型特征，初步判定所检测到的病毒种类。血清学检测鉴定使用检测鉴定试剂盒对提取物进行血清学检测鉴定（参见附录）。分子生物学检测鉴定

28、设计特异性引物对提取物进行分子生物学检测鉴定（参见附录）。侵染力测定植物种传病毒的侵染力测定，以及带毒率等定量检验是利用指示植物对某些病毒的特异性反应，参见生物学方法（见 ）。结果判定根据血清学特性、（或）生物学特性、（或）分子生物学特性、（或）电镜检查的结果进行鉴定。关键控制点虽然多数的指示植物通常能够产生明显的症状，但并不是都会产生症状，而且可能其他病毒也会产生相同症状，注意区别其他病毒或其他原因（如：药害、灼伤等）所引起的类似症状。必要时，采用 方法验证所产生的症状。有些指示植物还可用于繁殖病毒，以便于血清学或免疫电子显微镜或电镜观察等检测鉴定。植物病原线虫 漏斗检验法将种子用双层纱布或

29、吸水纸包好，或适当加以研磨，放入备好的漏斗内，漏斗的底部连接胶管和夹子（或其他设置），然后加水使种子浸没，在 下浸。收集漏斗底部的溶液，生物体视显微镜检查；或 离心 后取下部沉淀液检查线虫。主要用于检验种子外表所传带的线虫，如水稻干尖线虫（犃 狆 犺 犲 犾 犲 狀 犮 犺 狅 犻 犱 犲 狊 犫 犲 狊 狊 犲 狔 犻），以及外表没有症状的种子也可能携带大量的线虫。起绒草茎线虫（犇 犻 狋 狔 犾 犲 狀 犮 犺 狌 狊 ）的龄幼虫和成虫不仅寄生在种皮上，种子内部或子叶中，还混杂于种子的残体内。严重感染的种皮开裂，子叶上出现坏死病斑。有时大量的线虫在种子表面形成聚集出团，特别是在种脐的沟缝中

30、。浸泡分离法将虫瘿在湿润的滤纸上培养 后，充分吸涨的虫瘿，与正常的颖果比较，颜色变深、变软。用解剖针打开之后，就会释放出大量白色的幼虫。在 解剖镜下检查，测量长度和宽度。或称取 或适量的种子，在 的自来水中浸泡过夜。搅动种子，将浸泡水倒在烧杯里；杯中再加入 的水，静置，倒去上清液，取沉淀物检查。六月禾科（禾本科）的粒线虫病（犃 狀 犵 狌 犻 狀 犪 ），产生暗褐色至紫褐色或黑色的，圆形或卵形甚至雪茄状，约长的虫瘿；其颖片、外稃和内稃均比正常的长数倍。犛 犖犜 鉴定根据所分离到的线虫的形态特征和（或）分子生物学特性进行种类鉴定。样品保存植物种子应在干燥、低温、蔽光的条件下保存。所分离纯化的病原

31、真菌、细菌的菌种可以在室温或低温下保存；或在矿物油、土壤、灭菌蒸馏水等材料中保存；或在冷冻、液氮中保存。所分离的病毒可以保存在隔离检疫温室内，可以按照要求进行重复接种延续保存；或采集典型症状的叶片在超低温冰箱内保存，或经氯化钙脱水后，在超低温冰箱内保存。所分离的植物病原线虫杀死后，则于固定液中保存；或制作成玻片保存。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）主要种传病原真菌及其检验方法表 犃 主要种传病原真菌及其检验方法真 菌 种 类寄主推荐检验方法犃 犮 狉 犲 犿 狅 狀 犻 狌 犿狊 狋 狉 犻 犮 狋 狌 犿犖 犲 狅 狋 狔 狆 犺 狅 犱 犻 狌 犿狊 狋 狉 犻 犮 狋 狌 犿，犖 犲 狅

32、狋 狔 狆 犺 狅 犱 犻 狌 犿犾 狅 犾 犻 犻，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪犪 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狋 犪，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 犫 狉 犪 狊 狊 犻 犮 犪 犲 ，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 犫 狉 犪 狊 狊 犻 犮 狅 犾 犪，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 犫 狌 狉 狀 狊 犻 犻 犃犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪犮 犪 狉 狋 犺 犪 犿 犻 犃犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪犱 犪 狌 犮 犻，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪犱 犻 犪 狀 狋 犺 犻 犮 狅 犾 犪 犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪犺

33、 犲 犾 犻 犪 狀 狋 犺 犻 犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 犾 犻 狀 犻 犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 犾 犻 狀 犻 犮 狅 犾 犪，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪狆 犪 犱 狑 犻 犮 犽 犻 犻 犃 狊 犮 狅 犮 犺 狔 狋 犪狆 犻 狀 狅 犱 犲 狊 犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪狆 狅 狉 狉 犻 ，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 狉 犪 犱 犻 犮 犻 狀 犪，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 狉 犪 狆 犺 犪 狀 犻 ，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 狊 犲 狊 犪 犿 犻 ，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻

34、 犪 狊 犲 狊 犪 犿 犻 犮 狅 犾 犪 ，犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 狊 狅 犾 犪 狀 犻 犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪 狋 狉 犻 狋 犻 犮 犻 狀 犪 犃 犾 狋 犲 狉 狀 犪 狉 犻 犪狕 犻 狀 狀 犻 犪 犲，犃 狊 犮 狅 犮 犺 狔 狋 犪犳 犪 犫 犪 犲，犃 狊 犮 狅 犮 犺 狔 狋 犪犵 狅 狊 狊 狔 狆 犻 犻 犃 狊 犮 狅 犮 犺 狔 狋 犪狆 犻 狊 犻，犃 狊 犮 狅 犮 犺 狔 狋 犪 狉 犪 犫 犻 犲 犻，犃 狊 狆 犲 狉 犵 犻 犾 犾 狌 狊 犳 犻 犪 狏 狌 狊，犃 狊 狆 犲 狉 犵 犻 犾 犾 狌 狊 犳

35、狌 犿 犻 犵 犪 狋 狌 狊，犛 犖犜 表 犃（续）真 菌 种 类寄主推荐检验方法犃 狊 狆 犲 狉 犵 犻 犾 犾 狌 狊 狀 犻 犵 犲 狉，犃 狊 犮 狅 犮 犺 狔 狋 犪 犃 狊 狆 犲 狉 犵 犻 犾 犾 狌 狊 ，犃 狊 狆 犲 狉 犵 犻 犾 犾 狌 狊 狏 犲 狉 狊 犻 犮 狅 犾 狅 狉，犅 犲 犪 狌 狏 犲 狉 犻 犪 犫 犪 狊 狊 犻 犪 狀 犪，犅 犻 狆 狅 犾 犪 狉 犻 狊 狀 狅 犱 狌 犾 狅 狊 犪 ，犅 犻 狆 狅 犾 犪 狉 犻 狊犿 犪 狔 犱 犻 狊 ，犅 犻 狆 狅 犾 犪 狉 犻 狊犿 犻 狔 犪 犽 犲 犻 犅 犻 狆 狅 犾 犪 狉

36、 犻 狊 狅 狉 狔 狕 犪 犲 犅 犻 狆 狅 犾 犪 狉 犻 狊 狊 犲 狋 犪 狉 犻 犪 犲，犅 犻 狆 狅 犾 犪 狉 犻 狊 狊 狅 狉 狅 犽 犻 狀 犻 犪 狀 犪，犅 狅 狋 狉 狔 狅 犱 犻 狆 犾 狅 犱 犻 犪 狋 犺 犲 狅 犫 狉 狅 犿 犪 犲，犅 狅 狋 狉 狔 狋 犻 狊 犮 犻 狀 犲 狉 犲 犪，犅 狅 狋 狉 狔 狋 犻 狊 犳 犪 犫 犪 犲，犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 犫 犲 狋 犻 犮 狅 犾 犪犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 犮 犪 狉 狋 犺 犪 犿 犻 犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪犽 犻 犽 狌 犮 犺 犻 犻

37、，犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 狊 狅 犼 犻 狀 犪 犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 犮 狅 狉 犮 犺 狅 狉 犻 犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 犮 犪 狀 犲 狊 犮 犲 狀 狊 犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 犮 狉 狌 犲 狀 狋 犪 犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 ，犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 狅 狉 狔 狕 犪 犲 犆 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 狊 犲 狊 犪 犿 犻 ，犆 犾 犪 狏 犻 犮 犲 狆 狊 狆 狌 狉 狆 狌 狉 犲 狌 犿，犆 犾 犪 犱 狅 狊 狆 狅 狉 犻 狌 犿 ，犆 狅 犾 犾 犲 狋

38、狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犪 犮 狌 狋 犪 狋 狌 犿，犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犮 狅 狉 犮 犺 狅 狉 犻 犆 犾 犪 犱 狅 狊 狆 狅 狉 犻 狌 犿犮 狌 犮 狌 犿 犲 狉 犻 狀 狌 犿 犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犱 犲 犿 犪 狋 犻 狌 犿，犛 犖犜 表 犃（续）真 菌 种 类寄主推荐检验方法犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犵 犾 狅 犲 狅 狊 狆 狅 狉 犻 狅 犻 犱 犲 狊犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犵 狅 狊 狊 狔 狆 犻 犻，犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅

39、 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犵 狉 犪 犿 犻 狀 犻 犮 狅 犾 犪，犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 狀犺 犻 犵 犵 犻 狀 狊 犻 犪 狀 狌 犿 ，犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犾 犻 狀 犻 犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犾 犻 狀 犱 犲 犿 狌 狋 犺 犻 犪 狀 狌 犿，犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犾 犻 狀 犱 犲 狋 犺 犻 犪 狀 犻 狌 犿，犆 狅 犾 犾 犲 狋 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿 犆 狅 狉 狔 狀 犲 狊 狆 狅 狉 犪 犮 犪 狊 狊 犻 犻 犮 狅 犾 犪

40、 ，犆 狌 狉 狏 狌 犾 犪 狉 犻 犪 犾 狌 狀 犪 狋 犪，犇 犻 犱 狔 犿 犲 犾 犾 犪 犫 狉 狔 狅 狀 犻 犪 犲，犇 狉 犲 犮 犺 狊 犾 犲 狉 犪犵 狉 犪 犿 犻 狀 犲 犪，犇 狉 犲 犮 犺 狊 犾 犲 狉 犪 狅 狉 狔 狕 犪 犲 犇 狉 犲 犮 犺 狊 犾 犲 狉 犪 狋 犲 狉 犲 狊，犇 狉 犲 犮 犺 狊 犾 犲 狉 犪 狋 狉 犻 狋 犻 犮 犻 狉 犲 狆 犲 狀 狋 犻 狊 ，犈 狆 犺 犲 犾 犻 狊 狅 狉 狔 狕 犪 犲，犈 狓 狊 犲 狉 狅 犺 犻 犾 狌 犿狉 狅 狊 狋 狉 犪 狋 狌 犿，犉 狌 犾 狏 犻 犪犳 狌 犾 狏

41、犪 犌 犾 狅 犲 狅 犮 犲 狉 犮 狅 狊 狆 狅 狉 犪 狊 狅 狉 犵 犺 犻 犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿犪 狏 犲 狀 犪 犮 犲 狌 犿，犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿犮 狌 犾 犿 狅 狉 狌 犿 ，犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿犲 狇 狌 犻 狊 犲 狋 犻，犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿犳 犪 狉 犻 狀 狅 狊 犪犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿犵 狉 犪 犿 犻 狀 犲 犪 狉 狌 犿，犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿犿 狅 狀 犻 犾 犻 犳 狅 狉 犿 犲，犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿狆 犪 犾 犾 犻 犱 狅 狉 狅 狊 犲 狌 犿，犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿

42、狅 狓 狔 狊 狆 狅 狉 狌 犿，犛 犖犜 表 犃（续）真 菌 种 类寄主推荐检验方法犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿狅 狓 狔 狊 狆 狅 狉 狌 犿 犮 犻 犮 犲 狉 犻，犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿狅 狓 狔 狊 狆 狅 狉 狌 犿 犾 狔 犮 狅 狆 犲 狉 狊 犻 犮 犻 犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿狅 狓 狔 狊 狆 狅 狉 狌 犿 狆 犻 狊 犻，犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿狊 狅 犾 犪 狀 犻，犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿狊 狌 犫 犵 犾 狌 狋 犻 狀 犪 狀 狊犉 狌 狊 犪 狉 犻 狌 犿狊 狌 犫 犵 犾 狌 狋 犻 狀 犪 狀 狊 犉 狌 狊 犪 狉 犻

43、 狌 犿狊 狌 犫 犵 犾 狌 狋 犻 狀 犪 狀 狊，犕 犪 犮 狉 狅 狆 犺 狅 犿 犻 狀 犪狆 犺 犪 狊 犲 狅 犾 犻 狀 犪，犕 犲 犾 犪 犿 狆 狊 狅 狉 犪 犾 犻 狀 犻 犕 犻 犮 狉 狅 犱 狅 犮 犺 犻 狌 犿狀 犻 狏 犪 犾 犲，犕 狔 狉 狅 狋 犺 犲 犮 犻 狌 犿犾 犲 狌 犮 狅 狋 狉 犻 犮 犺 狌 犿犕 犻 犮 狉 狅 犱 狅 犮 犺 犻 狌 犿狅 狉 狏 狕 犪 犲 犕 狔 狉 狅 狋 犺 犲 犮 犻 狌 犿狉 狅 狉 犻 犱 狌 犿，犕 狔 狉 狅 狋 犺 犲 犮 犻 狌 犿狏 犲 狉 狉 狌 犮 犪 狉 犻 犪，犘 犲 狊 狋 犪 犾

44、 狅 狋 犻 犪狀 犲 犵 犾 犲 犮 狋 犪 ，犘 犲 狊 狋 犪 犾 狅 狋 犻 犪 ，犘 犲 狉 狅 狀 狅 狊 狆 狅 狉 犪犳 犪 狉 犻 狀 狅 狊 犪，犘 犲 狉 狅 狀 狅 狊 狆 狅 狉 犪犿 犪 狀 狊 犮 犺 狌 狉 犻 犮 犪，犘 犲 狉 狅 狀 狅 狊 狆 狅 狉 犪 狋 犪 犫 犪 犮 犻 狀 犪 犘 犲 狉 狅 狀 狅 狊 狆 狅 狉 犪狏 犻 犮 犻 犪 犲，犘 犲 狉 狅 狀 狅 狊 犮 犾 犲 狉 狅 狊 狆 狅 狉 犪 狊 狅 狉 犵 犺 犻，犘 犺 犪 犲 狅 犻 狊 犪 狉 犻 狅 狆 狊 犻 狊 犵 狉 犻 狊 犲 狅 犾 犪 犘 犺 狅 犿 狅 狆

45、 狊 犻 狊 狏 犲 狓 犪 狀 狊 犘 犲 狉 狅 狀 狅 狊 狆 狅 狉 犪狏 犻 犮 狋 犪 犲，犘 狔 狉 犻 犮 狌 犾 犪 狉 犻 犪犵 狉 犻 狊 犲 犪 ，犘 犺 狅 犿 犪 犫 犲 狋 犪 犲犘 犺 狅 犿 犪 犲 狓 犻 犵 狌 犪 犘 犺 狅 犿 犪 犲 狓 犻 犵 狌 犪 犲 狓 犻 犵 狌 犪，犘 犺 狅 犿 犪 犾 犻 狀 犵 犪 犿 ，犛 犖犜 表 犃（续）真 菌 种 类寄主推荐检验方法犘 犺 狅 犿 犪犿 犲 犱 犻 犮 犪 犵 犻 狀 犻 狊 狆 犻 狀 狅 犱 犲 犾 犾 犪 犘 犺 狅 犿 犪 狊 狅 狉 犵 犺 犻 狀 犪 犘 犺 狅 犿 犪 ，犘 犺

46、狅 犿 狅 狆 狊 犻 狊 ，犘 狉 狅 狋 狅 犿 狔 犮 犲 狊犿 犪 犮 狉 狅 狊 狆 狅 狉 狌 狊，犘 狌 犮 犮 犻 狀 犻 犪犪 狉 犪 犮 犺 犻 犱 犻 狊犘 狌 犮 犮 犻 狀 狋 犪 犮 犪 犾 犮 犻 狉 犪 狆 犪 犲，犘 狔 狉 犻 犮 狌 犾 犪 狉 犻 犪犵 狉 犻 狊 犲 犪 ，犘 狔 狉 犻 犮 狌 犾 犪 狉 犻 犪 狅 狉 狔 狕 犪 犲 犚 犺 犻 狕 狅 犮 狋 狅 狀 犻 犪 狊 狅 犾 犪 狀 犻 犚 犺 狔 狀 犮 犺 狅 狊 狆 狅 狉 狋 狌 犿狊 犲 犮 犪 犾 犻 狊 ，犛 犪 狉 狅 犮 犾 犪 犱 犻 狌 犿狅 狉 狔 狕 犪 犲

47、 犛 犮 犾 犲 狉 狅 狊 狆 狅 狉 犪犵 狉 犪 犿 犻 狀 犻 犮 狅 犾 犪，犛 犮 犾 犲 狉 狅 狋 犻 狀 犻 犪 狊 犮 犾 犲 狉 狅 狋 犻 狅 狉 狌 犿，犛 犲 狆 狋 狅 狉 犻 犪 犾 犻 狀 犻 犮 狅 犾 犪 犛 狆 犺 犪 犮 犲 犾 狅 狋 犺 犲 犮 犪 犮 狉 狌 犲 狀 狋 犪 犛 狆 犺 犪 犮 犲 犾 狅 狋 犺 犲 犮 犪 狉 犲 犻 犾 犻 犪 狀 犪 犛 狆 犺 犪 犮 犲 犾 狅 狋 犺 犲 犮 犪 狊 狅 狉 犵 犺 犻 犛 狆 犺 犪 犮 犲 犾 狅 狋 犺 犲 犮 犪 狉 犲 犻 犾 犻 犪 狀 犪，犛 狋 犪 犵 狀 狅 狊 狆

48、狅 狉 犪狀 狅 犱 狅 狉 狌 犿，犛 狋 犲 狀 狅 犮 犪 狉 狆 犲 犾 犾 犪犿 犪 犮 狉 狅 狊 狆 狅 狉 犪 ，犛 狋 犲 犿 狆 犺 狔 犾 犻 狌 犿犫 狅 狋 狉 狔 狅 狊 狌 犿 ，犛 狋 犲 狀 狅 犮 犪 狉 狆 犲 犾 犾 犪犿 犪 狔 犱 犻 狊 ，犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪 犫 犪 狉 犮 犾 犪 狔 犪 狀 犪，犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪 犮 狅 狀 狋 狉 狅 狏 犲 狉 狊 犪，犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪 犻 狀 犱 犻 犮 犪，犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪 犾 犪 犲 狏 犻 狊，犜 犻 犾 犾 犲 狋 犻 犪 狋 狉 犻 狋 犻 犮

49、 犻，犜 狅 犾 狔 狆 狅 狊 狆 狅 狉 犻 狌 犿狆 犲 狀 犻 犮 犻 犾 犪 狉 犻 犪 犲，犝 狉 狅 犿 狔 犮 犲 狊犫 犲 狋 犪 犲犝 狉 狅 犿 狔 犮 犲 狊狏 犻 犮 犻 犪 犲 犳 犪 犫 犪 犲，犝 狊 狋 犻 犾 犪 犵 犻 狀 狅 犻 犱 犲 犪狏 犻 狉 犲 狀 狊，犝 狊 狋 犻 犾 犪 犵 狅犪 狏 犲 狀 犪 犲 犝 狊 狋 犻 犾 犪 犲 狅犺 狅 狉 犱 犲 犻 犝 狊 狋 犻 犾 犪 犵 狅狀 狌 犱 犪 犛 犖犜 表 犃（续）真 菌 种 类寄主推荐检验方法犝 狊 狋 犻 犾 犪 犵 狅犿 犪 狔 犱 犻 狊，犝 狊 狋 犻 犾 犪 犵 狅 狋

50、狉 犻 狋 犻 犮 犻 犞 犲 狉 狋 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿犪 犾 犫 狅 犪 犾 狋 狉 狌 犿，犞 犲 狉 狋 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿犱 犪 犺 犾 犻 犪 犲，注：本表主要根据 牔 ，；：，。注：表中第列中字母含义为：琼脂 平 板 法；吸 水 纸 法；冰 冻 吸 水 纸 法；干 种 子 检 验 法；胚 胎 计 数 法；小苗症状检查；洗涤法。注：表中第列寄主的代码：犃 犮 犪 犮 犻 犪 金合欢；犃 犮 犲 狉狆 犪 犾 犿 犪 狋 狌 犿枫树；犃 犾 犫 犻 狕 犻 犪 合欢树；犃 犾 犾 犻 狌 犿 洋葱；犃 犾 狀 狌 狊犿 犪 狉 犻 狋 犻 狀 犪桤木；犃 狉