药品微生物实验室的质量管理及质量保证.ppt

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1、 药品微生物实验室的药品微生物实验室的质量管理及质量保证质量管理及质量保证 上海市药品检验所上海市药品检验所 钱维清钱维清 1加强药品微生物学检验加强药品微生物学检验质量保证的要求来自：质量保证的要求来自：药品安全形势的要求药品安全形势的要求 2005版药典版药典 2010版药典版药典要求要求 新药送审中要求新药送审中要求 药品药品GMP要求要求 国食药监安国食药监安2007648号附件号附件 药品药品GMP认证检查评定标准认证检查评定标准 2无菌检查无菌检查及微生物限度检查微生物限度检查是区分产品是否属于高风险产品的两个重要指标。3无菌检查和微生物限度检查的性质和特点无菌检查和微生物限度检查

2、的性质和特点药品的无菌和微生物限度检测是指按照一定的检测程序和质量控制措施，确定要求无菌的样品中是否存有活的微生物（定性试验一次检出不得复试一次检出不得复试）检验周检验周期期14天天！；！；或者，确定单位（g/ml）样品中存在微生物的数量（定量试验），及是否存在某种致病菌（定性试验一次检出不得复试一次检出不得复试）检验周期检验周期7天天决定决定了微生物检验质量保证的高要求了微生物检验质量保证的高要求 *4什么是检验质量？什么是检验质量？能按照产品的质量标准，提供出准确、可靠的检验数据，这些数据能够客观地反映出所检样品的本质。什么是微生物实验室的检验质量？什么是微生物实验室的检验质量？能准确地反

3、映出所检样品的微生物状况。5如何保证微生物实验室的检验质量和结果的准确性？如何保证微生物实验室的检验质量和结果的准确性？一、一、有能满足工作任务的完善、合理、科学的实验有能满足工作任务的完善、合理、科学的实验 室设施。（硬件）室设施。（硬件）二、二、有一整套可遵循的、科学的、有效的有一整套可遵循的、科学的、有效的 管理规范管理规范 和标准操作规范和标准操作规范(SOP)。（软件）。（软件）三、有训练有素的检验人员。（人）三、有训练有素的检验人员。（人）四、开展检验系统适用性验证。（法）四、开展检验系统适用性验证。（法）五、参加能力验证和实验室之间的比对。（质量保证五、参加能力验证和实验室之间的

4、比对。（质量保证活动）活动）六、进行质控样品的考核。六、进行质控样品的考核。（质量保证（质量保证活动）活动）6一、一、有能满足工作任务的完善、有能满足工作任务的完善、合理、科学的实验室设施和设备。合理、科学的实验室设施和设备。(硬件）硬件）7保证实验环境保证实验环境洁净室（无菌室）、隔离洁净室（无菌室）、隔离系统、净化工作台、生物安全柜。系统、净化工作台、生物安全柜。制备实验无菌器材制备实验无菌器材高压蒸汽灭菌器、电高压蒸汽灭菌器、电热恒温干燥箱。热恒温干燥箱。适合微生物生长和保存的适合微生物生长和保存的温控设备（培温控设备（培养箱、冰箱、低温冰柜等）养箱、冰箱、低温冰柜等）。8实验常用仪器实

5、验常用仪器电动匀浆仪、电热恒温水浴电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、无菌检查集菌仪、薄膜过滤装置、箱、离心机、无菌检查集菌仪、薄膜过滤装置、显微镜等显微镜等实验用玻璃仪器实验用玻璃仪器试管、三角烧瓶、刻度吸管试管、三角烧瓶、刻度吸管、双碟培养皿等。双碟培养皿等。菌种菌种鉴定仪器。鉴定仪器。等等全国微生物重点实验室的建立正在积极进行中全国微生物重点实验室的建立正在积极进行中9二、二、有一整套可遵循的、科学的、有效的有一整套可遵循的、科学的、有效的管理规范和标准操作规范。管理规范和标准操作规范。（软件）（软件）10规定质量方针、目标，描述管理体系的要素、要求、职责与途径质量手册实施体系各要素时涉

6、及各部门管理体系程序文件质量活动的程序（谁、做什么、何时、何地、如何做）标准操作规程 操作中的技术细节（作业指导 书、实施细则）（怎么做）记录（报告、表格、原始记录等）结果、表明体系正在运行 使用范围图图1管理体系文件结构管理体系文件结构检验工作11 依据和要求：依据和要求：药品药品GMP要求要求国食药监安国食药监安2007648号号附件附件药品药品GMP认证检查评定标准认证检查评定标准计量认证和认可委（计量认证和认可委（CNAS)的要求。的要求。(CNAS-CL09:2006)实验室现场评审核查表实验室现场评审核查表检测和校准实验室能力认可准则在微生物检检测和校准实验室能力认可准则在微生物检

7、测领域的应用说明测领域的应用说明2010年版药典年版药典新增附录新增附录Q药品微生药品微生物实验室规范指导原则物实验室规范指导原则。12设施、设备、菌种、培养基、样品、微设施、设备、菌种、培养基、样品、微生物实验废弃物等。生物实验废弃物等。微生物实验室的管理主要涉及：微生物实验室的管理主要涉及：13（一）微生物实验室洁净室的管理（一）微生物实验室洁净室的管理洁净实验室的建造要求洁净实验室的建造要求按药品按药品GMP要求要求国食药监安国食药监安2007648号附件号附件药品药品GMP认证检查评定标准认证检查评定标准中中第1101.1102.1301.1401.*1501.1504*1505.*1

8、601.1602.1603.1701.*1801.1901.*1903.2802等的规定等的规定14(CNAS-CL09:2006)检测和校准实验室能力认可检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明准则在微生物检测领域的应用说明对实验室设施的要求是以能获得可靠的生物检测结果为重要依据；实验室总体布局和各部位的安排应有利于减少潜在的对样本的污染和对人员的危害。15 对有洁净条件要求的工作区域应有明确标识。并能有效地进行控制、监测和记录 注意实验室间的有效隔离，有适当措施防止交叉污染。对进入无菌或净化等特定区域的人员应有效控制 有妥善处理废弃样品和有害废弃物的设施和制度，并且注意生物安

9、全。16 微生物实验用洁净室要求微生物实验用洁净室要求 洁净室（区）应具有高效单向流空气过滤的装置及除湿功能。分净化度为 1万 级的操作室和 10万 级的人流、缓冲间、物流、缓冲间。操作室内应具有100级工作区。相邻各室保持510pa的压差。室内温度应控制在1824，湿度应为4560%。设有能达到空气消毒的紫外灯和照明灯，照度为300勒克斯。17完善、完善、合理的实验辅助区域：合理的实验辅助区域：样品接收和储藏区、实验准备操作区标准菌株储藏区、细菌/真菌实验室（阳性对照室）、培养室、培养基及器材准备区实验物品灭菌处理区污染物处理区各区域应有明确标识。各区域应有明确标识。18洁净室室洁净度的度的

10、验证要求要求 单向流空气区与工作台面必须定期按国家标准GB/T16292-16294-现行版【医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法】进行洁净度验证。每年对洁净室（区）作一次洁净度再验证。并将每次验证结果记录归档保存备查！19洁净室使用管理洁净室使用管理1、建立洁净室使用与清洁维护标准操作规程。建立洁净室使用与清洁维护标准操作规程。如：如：SIFDC-SOP-GL-025洁净室的验证、使用与清洁维护洁净室的验证、使用与清洁维护标准操作规程标准操作规程SIFDC-SOP-JY-025B洁净室洁净室(区区)使用标准操作规程使用标准操作规程20洁净室使用洁净室使用SOP举例：举例：（

11、1）保持净化设备连续运转，否则每次实验前至少开启机房运转一小时以上，同时开启净化台和紫外灯。（2）凡进入洁净室（无菌室）的物品必须先在进入物流第1缓冲间时对外部表面进行消毒灭菌处理，然后置物流第缓冲间内开紫外灯进行进一步灭菌及经无菌空气吹干，再经物流传递窗送入无菌室。带纤维、易发尘物品不得带进净化实验室。*21 （3）实验人员进入洁净室（区）不得化妆、带手表、戒指等首饰，及吃东西、嚼口香糖等。应先洗手。在第一缓冲间内换上消毒隔离鞋，戴上灭菌手套，更衣换上灭菌连裤衣帽（不能让头发、衣袖、手表等暴露在外面），戴上灭菌口罩。然后换第二副灭菌手套，在进入第二缓冲间时换第二双消毒隔离拖鞋。再进入无菌室。

12、*22（4）观察温度计、湿度计上显示的温湿度是否在规定的范围内，并作为实验原始数据记录在案。如发现问题应及时寻找原因，及时报修和及时报告实验室主管，并将报修原因和结果记录归档。*23 （5）在每次实验同时对操作室和净化台做微生物沉降菌测定并有记录。*方法如下：取内径90mm平皿无菌操作注入融化的肉汤琼脂培养基20ml制成平板，在3035预培养24小时应无菌生长。取经预培养过的6只琼脂平皿，三只置净化室左、中、右，三只置净化台左、中、右。开始检验操作即打开6个平皿盖，实验完毕将盖盖好。置3035培养48小时后点计菌落数。洁净室3只平皿平均菌落数不得超过3个，单只平皿菌落数不得超过4个。净化台3只

13、平皿菌落数平均不得超过0.5个。*24（6）必要时在实验同时对操作室和净化台进行浮游菌测定。方法见浮游菌测定仪操作规程；标准：万级应不得过100个/m3，百级应不得过5个/m3（7）为保证洁净能力，每年一次更换新的紫外灯管，每二年检查和更换高效过滤头。并将更换结果记录归档保存备查！25洁净室清洁、维护洁净室清洁、维护SOP举例举例（1）每次试验后均应用消毒溶液清洁工作台面、地板、传递窗、门把手。清洁消毒程序从内向外，从高洁净区到低洁净区。（2）每月末进行一次彻底清洁工作，用消毒溶液清洁工作台面、地板、墙面、天花板、传递窗、门及门把手。清洁消毒程序从内向外，从高洁净区到低洁净区。26（3）为防止

14、微生物耐受性，应定期更换消毒剂品种，品种有：520倍稀释的碘伏溶液、0.1%新洁尔灭溶液、1：50的84消毒液、75%乙醇溶液、3%碘酒溶液、5%石炭酸（来苏儿）消毒溶液、尼泊金酒精消毒液（处方：对羟基苯甲酸甲脂21.5g，对羟基苯甲酸丙脂8.6g，75%乙醇10.0L）等。（4）消毒剂浓度与实际消毒效果密切相关，应按规定准确配制。（5）应注意每种消毒溶液的消毒容量（能力），及需消毒物的污染程度，一般每1.5L消毒剂所檫洗面积不得大于2.5平方米，以确保清洁、灭菌效果。272、建立、建立洁净室洁净室使用登记表。使用登记表。如：如：SIFDC-BG-126D洁净室（区）使用、维修登记表洁净室（区

15、）使用、维修登记表SIFDC-BG-083D洁净室（区）的清洁、维护记录表洁净室（区）的清洁、维护记录表逐月保存并定期归档备查！逐月保存并定期归档备查！*28（二）微生物实验设备的管理（二）微生物实验设备的管理高压灭菌锅管理高压灭菌锅管理（1 1）档案建立：）档案建立：从开箱验收记录调试记录专人负责制操作规程（SOP）定期校验检定使用登记维修记录改造或更新记录报废记录。应贯穿设备的一生。（2）压力表定期校验）压力表定期校验 应由计量测试院定期强检，以确保消毒质量和使用安全。并贴有绿色合格标识后使用。29（3）灭菌条件的验证：）灭菌条件的验证：应按照2005年版中国药典附录灭菌法中规定，根据物品

16、的性质选择灭菌程序：12115分钟、12130分钟、11640分钟必须保证物品灭菌后的SAL10-6由有资质的单位进行验有资质的单位进行验证。证。验证资料归档保存。验证资料归档保存。30（4）操作）操作SOP的建立的建立如：如：SIFDCSOP-YQ-207B立式压力蒸汽灭菌器标准操作立式压力蒸汽灭菌器标准操作规程规程（5）建立使用记录、维护记录）建立使用记录、维护记录：如：SIFDC-BG-YQ-013D年高压灭菌锅（编号：年高压灭菌锅（编号：）使用记录）使用记录31高压灭菌器操作高压灭菌器操作SOP的编写，除按各种型号使用说明书的编写，除按各种型号使用说明书中的操作步骤要求外，还应有灭菌操

17、作指导内容。中的操作步骤要求外，还应有灭菌操作指导内容。高压灭菌锅操作高压灭菌锅操作SOP举例如下：举例如下：由于灭菌保证值与污染菌的耐热性和污染量有关，因此，在制备实验所需的无菌用品的各个环节均应采取各种有效的手段（包括预先煮沸、除菌过滤、分装防污染等措施）来降低待灭菌物品的微生物污染。32待灭菌物品的表面必须洁净，不污染有机物质，三角烧瓶、试管、等玻璃容器应有相应的塞子（胶木螺旋盖、乳胶塞）排列置于铁丝筐中，外面应有适宜的宽松的包皮或放在储槽内。防止灭菌物品送入无菌室前的再污染。33 放入灭菌器内的物品，不能排列过密，应保证高压蒸汽的流通及有效穿透力。应完全排出高压蒸汽灭菌器内的冷空气以保

18、证达到规定的温度，如有冷空气没有排尽，虽然压力达到，但温度不能达到规定的要求，灭菌就不彻底。进行灭菌效果监测：选择物理、化学指示剂和生物指示剂进行灭菌效果监测和验证。留底温度计、三M试纸、嗜热脂肪芽孢杆菌*，并在灭菌记录中有记录34净化工作台的管理净化工作台的管理（1）档案建立：）档案建立：从开箱验收记录调试记录专人负责制操作规程（SOP）洁净度验证使用登记维修记录高效过滤更换记录报废记录。应贯穿设备的一生。（2）定期洁净度验证）定期洁净度验证（3）操作）操作SOP的建立的建立（4）建立使用记录、维护记录）建立使用记录、维护记录：35净净化化工工作作台台操操作作SOP的的编编写写，除除按按各各

19、种种型型号号使使用用说说明书中的操作步骤要求外，还应有操作指导内容。明书中的操作步骤要求外，还应有操作指导内容。净化工作台使用净化工作台使用SOP举例：举例：启动净化台前用70的酒精或其它适当的消毒剂擦拭层流台的整个内表面并开启紫外灯，确保层流台运行30分钟以上。进入洁净室前关闭紫外灯。检验操作时不得打开紫外灯。防止紫外线对实验人员眼睛、皮肤的损伤及影响实验结果的真实性。36操作人员的手、手臂及头部是最主要的污染源，操作时务必戴上灭菌手套、帽子、口罩。手套必须将袖口包住。头部绝对不得伸入操作区。在操作区内使用酒精灯前，必须确证气流方向，防止火焰过大，影响操作人员和高效过滤器的安全。37 仔细计

20、划好实验操作步骤，避免将不必要的物品放进层流区内。应根据层流方向将无菌要求高的物品放在上游。对水平层流而言，层流区内操作及物品排放应注意前后(气流方向)重叠，防止洁净气流受物品阻挡而产生涡流使物品间发生交叉污染。对垂直层流而言，物品应存放在操作区的左侧或右侧，操作时避免上下重叠。38 因层流台的外周和邻近区域存在被污染的空气。人员走动或操作应注意轻手轻脚，轻拿轻放，防止对无菌操作带来不良影响。实验结束后，用消毒剂擦试整个层流台内表面，然后再关闭风机电源。打开紫外灯。消毒灭菌30分钟以上。根据使用情况，定期更换层流台空气高效过滤层。每次更换后应做洁净度验证，并将更换日期、洁净度验证结果记录备查在

21、无菌室使用登记册上39（三）实验用菌种的管理：（三）实验用菌种的管理：应符合：应符合：中国药典中国药典2010年版相关规定年版相关规定和和(CNAS-CL09:2006)检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明检测领域的应用说明 菌种管理的菌种管理的重要性重要性 在微生物检验中用的菌种，相当于在理化分析中用的对照品。微生物实验室对菌种的管理除了相当于化学实验室对对照品的管理要求外，还有菌种保存的特殊性。40溯源性、有记录溯源性、有记录微生物检验室用于验证试验、阳性对照试验、培养基适用性试验等的对照菌种，应是一批形态、生物化学、血清学特性稳定的标

22、准菌株，这些菌株应来自中国药品生物制品检定所的中国医学菌种保藏中心（中国医学菌种保藏中心（CMCC）系列系列或美国菌种保藏中心（美国菌种保藏中心（ATCC）系列系列等等菌种保藏机构菌种保藏机构的的冷冻干燥菌种。冷冻干燥菌种。41CNAS-CL09：2)实验室应有文件化的菌种管理程序（从原始菌种到日常工作用菌）该程序应包括：a)参照菌种是否定期转种传代，并做确认试验，包括实验室中所需要的关键诊断指标？实验室是否加以记录并予以保存？b)每一支参照菌种都应以适当的标签、标记或其它标识方式来表示其名称、标准号、接种日期和所传代数。42c)其管理记录中还应包括（但不限于）以下内容：从原始菌种传代到工作用

23、菌种的代数；菌种生长的培养基及孵育条件；菌种生存条件。要求上述要求上述a)、b)、c)均应有记录。均应有记录。43实验室应做的质量管理工作：实验室应做的质量管理工作：（1）建立菌种管理程序）建立菌种管理程序如：如：SIFDC-CX-030菌种管理程序菌种管理程序（2）菌种保管岗位持证上岗）菌种保管岗位持证上岗（3）建立菌种转种操作）建立菌种转种操作SOP.如：如：SIFDC-SOP-GL-023C检验用菌种保管与转种传检验用菌种保管与转种传代管理标准操作规程代管理标准操作规程44（4）建立菌种的领用制度）建立菌种的领用制度如：如：SIFDC-BG-165D菌菌种种传传代代领领用用记记录录（5）

24、进行菌种保管的定期检查。）进行菌种保管的定期检查。如：如：SIFDC-BG-100D菌种保管与转种传代的检查记录菌种保管与转种传代的检查记录45 菌种管理举例：菌种管理举例：1、菌种申购，应有室主任同意签字。2、指定专人负责保管，并持证上岗。3、建立菌种购入、领用进出帐册。4、有菌种专用冰箱加锁保藏。5、微生物实验室应分保藏菌种和工作用菌种。466、专人负责定期转种、传代工作。每次转种应 严格核对慎防混淆。7、有转种、传代记录：日期、菌种名称、编号、传代次数、培养基、培养温度、菌落型态、确认试验、转种传代人签名。8、保藏菌种控制传代次数不超过5代9、转种后上一次菌种应高压灭菌后清洗。10、每管

25、工作用菌种斜面开启后不得重复使用。并高压灭菌处理。47 以上10点均应在建立的菌种管理文件（菌种管理程序、菌种管理标准操作规范（GL-SOP）、菌种转种传代标准操作规范（SOP)、菌种转种传代领用记录）有体现。48（四）实验用培养基的管理：（四）实验用培养基的管理：应符合应符合中国药典中国药典2010年版有关规定及年版有关规定及(CNAS-CL09:2006)实验室现场评审核查表实验室现场评审核查表检测和校准实验室能检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明力认可准则在微生物检测领域的应用说明实验室应建立和保持有效的适合试验范围的培养基（试剂）质量控制程序49对所有自备培养基的配制

26、须有记录，记录内容至少含有：培养基名称和类型；配制日期和配制人员的标识；培养基/溶液的类型、体积；分装的体积；成分、每个成分物质的含量、制造商、批号；pH（最初和最终）值；无菌措施，包括实施的方式、时间和温度。50应做的质量管理工作：应做的质量管理工作：（1）建立培养基质量控制程序）建立培养基质量控制程序如：SIFDC-CX-035C培养基质量控制程序（2）培养基的配制操作）培养基的配制操作SOP如：SIFDC-SOP-JY-028B培养基配制标准操作规程（3）培养基配制记录）培养基配制记录如：SIFDC-YSJL-034E-1/1培养基配制原始记录（成品）51 培养基培养基储藏保管注意：储藏

27、保管注意：干粉培养基包装未开启使用前应储藏在阴凉干燥处，开启使用后的应置冰箱储藏，防止微生物生长、吸潮、结块、变质。应有专人保管并建立帐册。帐目立项：进货日期、品名、规格、批号、数量（瓶）、领用日期、领用数量、领用人等。52培养基质量控制注意培养基质量控制注意;每批新购进的培养基，应及时按药典要求作适用性（灵敏度）质量检查，应符合规定。灵敏度质量检查原始记录应归入培养基帐册。如果灵敏度质量检查结果不符合规定，则该批培养基应作退货或报废处理。如已发生用不合格培养基获得的微生物学实验数据均应作无效论处。53 培养基制备中的质量控制注意培养基制备中的质量控制注意：配制培养基应采用玻璃容器，以避免接触

28、金属离子。称量应迅速，防止吸潮影响称量准确。称量应有校对。应用水浴加热溶化，不能直火加热。防止结底焦化。影响培养基的营养。配制后应测定培养基灭菌前后的pH值，以确认pH值在适宜微生物生长的范围内。一般用10NaOH液和稀盐酸调节pH至规定的范围。54严格遵守用验证过的灭菌程序灭菌。（温度和时间）灭菌后的培养基应注意避光保存，防止第二次污染。应有配制培养基的原始记录记录项目：日期、品名、规格、批号、称量数（克）、稀释数（ML）、灭菌前pH、灭菌后pH、灭菌起始时间、灭菌结束时间、温度、压力、配制人、校对人。SIFDC-YSJL-034E-1/1培养基配制原始记录55（五）微生物实验有害废弃物管理

29、（五）微生物实验有害废弃物管理应符合实验室安全条例应符合实验室安全条例的要求及的要求及(CNAS-CL09:2006)(CNAS-CL09:2006)检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明用说明 实验室是否有妥善处理废弃样品和有害废弃物的设施和制度？并且注意生物安全？56需做的质量管理工作：需做的质量管理工作：（1）建立）建立灭活和防污染控制程序灭活和防污染控制程序见：SIFDC-CX-020C灭活和防污染控制程序（2）建立实验后带菌废弃物消毒灭菌标准操作规程）建立实验后带菌废弃物消毒灭菌标准操作规程如：SIDC-SOP-GL-0

30、35C微生物实验有害废弃物处理标准操作规程（3）废弃物处理和灭活记录。）废弃物处理和灭活记录。57（3）带菌废弃物消毒灭菌记录。）带菌废弃物消毒灭菌记录。如：SIFDC-BG-154D微生物实验有害废弃物湿热灭菌处理登记表58三、有训练有素的检验人员。三、有训练有素的检验人员。59人是质量管理的主体，人员的素质对质量体系的人是质量管理的主体，人员的素质对质量体系的运行起着极为重要的影响。运行起着极为重要的影响。微生物实验人员应符合：微生物实验人员应符合：中国药典2010年版中的要求:微生物实验人员应具备微生物专业知识。60CNAS-CL09检测和校准实验室能力认可准则在微生物检检测和校准实验室

31、能力认可准则在微生物检测领域的应用说明测领域的应用说明第第5.2.1节要求：节要求：实验室使用人员时，应考虑以下条件a)有颜色视觉障碍的人员不能执行某些涉及到辨色的试验。b)实验室人员是否熟悉生物检测安全操作知识和消毒知识？c)实验室是否对在培人员实施有效监督？d)实验室是否对新员工进行检测技能的培训，对新员工的检测技能进行确认？61 国食药监安国食药监安2007648号附件号附件药品药品GMP认证检查评定标认证检查评定标准准中第中第*0606条条要求：要求：“从事药品质量检验的人员应通过相应专业技术培训后上岗，具有基础理论知识和实际操作技能”；第第*0609条要求：条要求：“进入洁净区的工作

32、人员（包括维修、辅助人员）应定期进行卫生和微生物学基础知识、洁净作业等方面的培训和考核。62管理对管理对微生物检验人员的要求：微生物检验人员的要求：具有微生物学、生物化学、分析化学等基础理论专业知识。接受过无菌技术和卫生要求的培训。经过岗位考核取得上岗操作资格证。参加单位年度培训和继续教育，不断努力学习微生物专业技术，进行知识和技术的更新。非专业技术人员、无专业技术职称者不得从事药品微生物学检验。微生物专业检验人员不宜随便更换。微生物专业检验人员不宜随便更换。63四、四、开展开展微生物实验系统适用性验证微生物实验系统适用性验证64国家食品药品监督管理局国家食品药品监督管理局食药监办食药监办20

33、0723号文中规定号文中规定“对无菌、微生物限度检查进行方法学验证是中国药典2005年版的一个重要变化，目的是提高检验方法的可靠性和科学性。对所有进行无菌、微生物限度检查的品种，药品生产企业必须采用经过验证的方法检验，以保障得出可靠的结论。”“药品无菌、微生物限度检查方法的验证工作属于检验方法学研究的范畴，在建立药品的检验方法时必须进行验证。如果企业在注册时缺少该方面的资料，应责成其补充。”*65无菌实验无菌实验环境细菌环境细菌的监测的监测药品的无药品的无菌检测菌检测环境细菌与药环境细菌与药品细菌的比较品细菌的比较结论结论判断无菌检查结果有效的方法判断无菌检查结果有效的方法66 无菌检查实验中

34、：无菌检查实验中：1、实验过程的洁净环境监控验证：实验过程的洁净环境监控验证：浮游菌测定、沉降菌测定。方法：按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。2 2、操作者无菌衣、手套的监控验证：操作者无菌衣、手套的监控验证：灭菌衣、灭菌手套的无菌检查。方法：按无菌检查法中的直接接种法检查 操作前、操作结束时的手印培养。方法：将手印按在培养基平板上培养后计数和分析。67 3、设备表面、设备表面、样品表面无菌性监控验证样品表面无菌性监控验证 方法：用接触碟法或用经无菌生理盐水湿润后的无菌棉签涂抹需采样的表面约 25cm2 后分别接种到无菌检查的两种培养基中后培

35、养应无菌生长，接触碟经培养后应无菌落生长。68 4 4、培养基适用性检查。、培养基适用性检查。培养基质量的优劣对微生物的生理活性和代谢能力有很大影响,直接关系到样品中微生物的生长，影响实验结果的准确性。培养基灵敏度检查 培养基无菌性检查 方法：中国药典2005年版 无菌检查法中 69 5 5、样品所用检验方法和条件的验证、样品所用检验方法和条件的验证 （确保已充分消除样品抑菌性）方法：中国药典2005年版 无菌检查法70无菌检查验证思路和步骤无菌检查验证思路和步骤 某种样品样品采用某种方法方法 检验得到准确可信结果准确可信结果证明供试品是否有抑菌活性证明采用有效的方法消除抑菌活性记录实验过程，

36、形成验证报告、形成标准操作规范（SOP）71 6 6、实验同时的阳性对照、阴性对照试验。、实验同时的阳性对照、阴性对照试验。阳性对照验证：如果有菌肯定能得到生长；阳性对照验证：如果有菌肯定能得到生长；阴性对照验证：所用物品阴性对照验证：所用物品的无菌性。的无菌性。是对实验是否成立的验证，是对实验是否成立的验证，具有具有对方法验证后在具体实验对方法验证后在具体实验 室使用中的简单的再验证性质。室使用中的简单的再验证性质。（经经常常碰碰到到提提问问：我我们们的的产产品品检检验验方方法法已已经经过过验验证证，按按产产品品的的验验证证方方法法实实验验的是否可以不做阳性对照、阴性对照试验了）的是否可以不

37、做阳性对照、阴性对照试验了）方法：药典无菌检查法规定方法：药典无菌检查法规定727 7、对对检检出出微微生生物物的的定定量量、定定性性及及追追溯溯的的准准确性保证确性保证 积累实验过程环境中收集到的微生物，逐个对其进行必要的鉴定，定性到种、族，并做好纯菌种的保藏，逐步建立起可能污染实验环境的菌谱库。将产品中捡出的菌进行鉴定，定性到种、族，在实验环境的菌谱库中进行检索，排除实验过程中环境污染的可能。73菌种鉴定定性方法：菌种鉴定定性方法：（1）生化试验：）生化试验：药典上控制菌检查中的方法药典上控制菌检查中的方法梅里埃梅里埃API试剂条试剂条微生物自动鉴定仪：微生物自动鉴定仪：VITK 等等74

38、（2）红外测定法）红外测定法75(3）上海市所开展的）上海市所开展的分子生物学分子生物学 16 SR DNA 测序和序列分析测序和序列分析方法：方法：PCR扩增扩增测序仪测序仪软件分析软件分析上美上美国的国的Gen Bank网进行数据比对网进行数据比对定性定性（种）（种）76 成立药品微生物学检验重点实验室成立药品微生物学检验重点实验室（共（共10个）个）中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所 中国人民解放军总后药品检验所中国人民解放军总后药品检验所 上海食品药品检验所上海食品药品检验所 黑龙江省药品检验所黑龙江省药品检验所 北京药品检验所北京药品检验所 江苏省食品药品检验所江苏省食品药

39、品检验所 浙江省食品药品检验所浙江省食品药品检验所 成都市食品药品检验所成都市食品药品检验所 广东省食品药品检验所广东省食品药品检验所 广西省食品药品检验所广西省食品药品检验所77 微生物限度实验中：微生物限度实验中：1 1、实验过程的洁净环境监控：实验过程的洁净环境监控：可以只进行浮游菌测定 方法：按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。2、操作者灭菌衣、灭菌手套的监控：操作者灭菌衣、灭菌手套的监控：灭菌衣、灭菌手套的无菌检查。方法：按无菌检查法中的直接接种法检查 操作前、操作结束时的手印培养。方法：将手印按在培养基平板上培养后计数和分析。78

40、3、设备表面、设备表面、样品表面无菌性验证样品表面无菌性验证 方法：用接触碟法或用经无菌生理盐水湿润后的无菌棉签涂抹需采样的表面约 25cm2 后分别接种到无菌检查的两种培养基中后培养应无菌生长，接触碟经培养后应无菌落生长。79 4 4、培养基适用性检查。、培养基适用性检查。培养基质量的优劣对微生物的生理活性和代谢能力有很大影响,直接关系到样品中微生物的定量、定性分析结果的准确性。培养基灵敏度检查 培养基无菌性检查 方法：即将在方法：即将在20102010年版中国药典中有要求年版中国药典中有要求80 5 5、样样品品所所用用检检验验方方法法和和条条件件的的验验证证（确确保保已已充分消除样品抑菌

41、性）充分消除样品抑菌性）方法：中国药典2005年版 微生物限度检查法 菌数计数的验证试验 控制菌检查的验证试验 在在20102010年版药典中有一定的修订！年版药典中有一定的修订！81微生物限度检查验证思路和步骤微生物限度检查验证思路和步骤需前处理不需前处理有抑菌作用无抑菌作用样品样品检查检查去除抑菌作用验证前处理方法对污染菌生长、验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响检出的影响。验证抑菌活性去除的有验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污效性，以及去除方法对污染菌生长、检出的影响。染菌生长、检出的影响。可以通过验可以通过验证实验判断证实验判断记录实验过程，形成验证报告、形成标准操作规范（S

42、OP）82 6 6、控制菌检查实验同时的阳性对照、阴性对照试验。、控制菌检查实验同时的阳性对照、阴性对照试验。阳性对照验证：如果有该控制菌存在肯定能得到生长；阴性对照验证：所用物品无该控制菌。是对实验是否成立的验证，具有对方法验证后在具体实验 室使用中的简单的再验证性质。方法：中国药典2005年版 微生物限度检查法 83样品所用检验方法和条件的验证试验是样品所用检验方法和条件的验证试验是指验证什么？指验证什么？1 1、验证样品是否具有抑菌性、验证样品是否具有抑菌性2 2、验证所用的方法已充分消除样品抑菌性、验证所用的方法已充分消除样品抑菌性 84五、参加能力验证和实验室之间的比对五、参加能力验

43、证和实验室之间的比对（外部质量保证活动）外部质量保证活动）85(CNAS-CL09:2006)(CNAS-CL09:2006)检检测测和和校校准准实实验验室室能能力力认认可可准准则则在在微生物检测领域的应用说明微生物检测领域的应用说明中要求：5.9检测检测和校准和校准结结果的果的质质量保量保证证 实验室应制订质量控制计划实验室应制订质量控制计划 有对外部质量控制和内部质量控制活动的实施内容、方式、责任人等作出明确的规定。对内部质量控制活动，计划中应给出结果评价依据。86（1）参加外部组织的能力验证的结果和记录（2）参加实验室之间的比对结果和记录以验证本实验室的检测能力！以验证本实验室的检测能力！*87六、开展质控样品的考核。六、开展质控样品的考核。（内部质量保证活动）内部质量保证活动）88（1）样品再测的结果和记录。（2）制备污染微生物样品的考核结果和记录。以检查人员的检测能力！以检查人员的检测能力！*89谢谢谢谢！90