1.2基因工程的基本操作程序2010.3.ppt

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1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。并与其结合。转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并分子移动，并以以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧

2、接着RNARNA聚聚合酶也从合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终

3、止子补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子：能编码蛋白质的序列子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作

4、用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非非编码序列：编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区

5、编码区非编码非编码基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的方法有哪些途径、获取目的基因的方法有哪些途径?（1 1）从已有的物种分离出来）从已有的物种分离出来（2 2）人工的方法合成）人工的方法合成请阅读请阅读P9P9第

6、一和二两段第一和二两段(一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库称为基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）1.1.基因文库基因文库基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系怎样从基因文库中得怎样从基因文库中得到我们所需的目的基到我们所需的目的基因呢因呢?从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因根据目的基因的有关信息

7、，随时从中提取所需要的目的基因，引入受体细胞使知表达。思考思考:为什么要构建基因文库为什么要构建基因文库?直接从含有目直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗的基因的生物体内提取不行吗?n n建构基因文库是获取目的基因的方法之一，建构基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一方法。如果所需的目的基因序并不是唯一方法。如果所需的目的基因序列已知，就可以通过列已知，就可以通过PCR方式从含有该基方式从含有该基因的生物的因的生物的DNA中，直接获得；也可以通中，直接获得；也可以通过反转录，用过反转录，用PCR方式从方式从mRNA中获得。中获得。n n如果目的基因的如果目的基因的 序列部分或全部不知；

8、或序列部分或全部不知；或想从一种生物体内获取许多基因，或想得想从一种生物体内获取许多基因，或想得到一种生物的全基因组序列，往往需要建到一种生物的全基因组序列，往往需要建构基因库。构基因库。(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_、_ _、_._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：选修选修3 P3 P1010聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定

9、特定DNADNA片段片段DNADNA双链复制双链复制一段已知基因的核苷酸序列一段已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因一段已知基因的核苷酸序列一段已知基因的核苷酸序列过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温

10、度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d、多次重复、多次重复DNA合成仪器合成仪器根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的信使出相应的信使RNARNA序序列，然后按照碱基互列，然后按照碱基互补配对原则，推测出补配对原则，推测出它的结构基因的核苷

11、它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成反转录法：反转录法：以目的基因转录成以目的基因转录成的信使的信使RNARNA为模板，反为模板，反转录成互补的单链转录成互补的单链DNADNA，然后在酶的作用下合然后在酶的作用下合成双链成双链DNADNA，从而获得从而获得所需的基因。所需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反转录酶反

12、转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA(目的基因目的基因)1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。二、二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒质粒DN

13、ADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）核心核心同一种同一种(二二)基因表达载体的构建基因表达载体的构建4.4.过程过程:基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心目的：目的：所需物质：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因能够表达和发挥作用。它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?目的基因目的

14、基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因三、三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1 1）农杆菌介

15、绍：）农杆菌介绍：（2 2）原理及适用范围）原理及适用范围2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（2）程序：）程序：3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：）方法：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感受态表达载体与感受态细胞混合细胞混合 感受感受态态细胞吸收细胞吸收DNA分子

16、分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将

17、两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。P P1515思考与探究思考与探究1.以下说法正确的是（以下说法正确的是（）A.所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B.质粒是基因工程中唯一的运载体质粒是基因工程中唯一的运载体 C.运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之

18、之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D.基因控制的性状都能在后代表现出来基因控制的性状都能在后代表现出来C C练习练习2.有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是 （）A.限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D D练习练习3.基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本

19、本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基互补配对的步骤是（基互补配对的步骤是（）A.人工合成目的基因人工合成目的基因 B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C C练习练习4.限限制制酶酶能能识识别别特特定定的的DNA序序列列进进行行剪剪切切，不不同同的的限限制制酶酶可可以以对对不不同同的的核核酸酸序序列列进进行行剪剪切切。现现以以3种种不不同同的的限限制制酶酶a、b、c对对6.2kb大大小小的的线线性性DNA进进行行剪剪切切，用用凝凝胶胶电电泳泳分分离离各各核核酸酸片片段段，实实验验结结果果如如右右

20、图图所所示示。那那么么3种种不不同同的的限限制制酶在此酶在此DNA片段上的相应切点位置是：片段上的相应切点位置是：4.限限制制酶酶能能识识别别特特定定的的DNA序序列列进进行行剪剪切切，不不同同的的限限制制酶酶可可以以对对不不同同的的核核酸酸序序列列进进行行剪剪切切。现现以以3种种不不同同的的限限制制酶酶a、b、c对对6.2kb大大小小的的线线性性DNA进进行行剪剪切切，用用凝凝胶胶电电泳泳分分离离各各核核酸酸片段，实验结果如右图所示。那么片段，实验结果如右图所示。那么3种不同的限制酶在此种不同的限制酶在此DNA片段上的相应切点位置是：片段上的相应切点位置是：A.B.C.D.D5.酵酵母母菌菌

21、的的维维生生素素、蛋蛋白白质质含含量量高高，可可生生产产食食品品和和药药物物。科科学学家家将将大大麦麦细细胞胞中中的的LTP1基基因因植植入入啤啤酒酒酵酵母母菌菌中中，获获得得的的啤啤酒酒酵酵母母可可产产生生LTP1蛋蛋白白，并并酿酿出出泡泡沫沫丰丰富富的的啤啤酒酒，具体的操作过程如下图。具体的操作过程如下图。从从大大麦麦细细胞胞中中可可直直接接分分离离获获得得LTP1基基因因，还还可可采采用用_的的方方法法获获得得目目的的基基因因。在在本本操操作作中中为为了了将将LTP1基因导入酵母菌细胞中，所用的载体是基因导入酵母菌细胞中，所用的载体是_。人工合成人工合成人工合成人工合成质粒质粒质粒质粒图

22、图中中LTP1基基因因与与B结结合合产产生生的的C是是_，此此过过程通常在体外完成，必需有限制酶和程通常在体外完成，必需有限制酶和_参与。参与。重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶标志基因的作用是：标志基因的作用是：_。鉴定和选择含有目的基因的细胞鉴定和选择含有目的基因的细胞鉴定和选择含有目的基因的细胞鉴定和选择含有目的基因的细胞在在此此操操作作中中可可以以分分别别用用含含有有青青霉霉素素、四四环环素素的的两两种种选选择择性性培培养养进进行行筛筛选选，则则有有“C”进进入入的的酵酵母母菌菌在在这这两两种种培培养养基上的生长情况是：基上的生长情况是：_ _。能在含有青霉素的培养基上生长，能在含有青霉素的培养基上生长，能在含有青霉素的培养基上生长，能在含有青霉素的培养基上生长，但不能在含有四环素的培养基上存活但不能在含有四环素的培养基上存活但不能在含有四环素的培养基上存活但不能在含有四环素的培养基上存活检检测测LTP1基基因因在在酵酵母母菌菌中中是是否否表表达达，除除了了看看啤啤酒酒泡泡沫沫是是否否丰丰富富外外，还还可可以以检检测测转转基基因因啤啤酒酒酵酵母母菌菌能能否否产产生生_。LTP1LTP1蛋白蛋白蛋白蛋白