指纹图谱标记.ppt

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1、南京林业大学南京林业大学2011届毕业论文答辩届毕业论文答辩PPT题目：石竹属DNA指纹图谱构建学生：朱烨指导老师：徐立安 教授 2011年6月3日汇报的主要内容汇报的主要内容l1.研究的目的及意义l2.研究材料与方法l3.结果分析l4.讨论1.目的及意义目的及意义l目的：利用SRAP和ISSR分子标记法构建石竹属DNA指纹图谱l意义：此图谱的构建，一方面，为今后石竹属种间鉴定提供快速、科学的参照标准。另一方面，也为香石竹（康乃馨）杂交育种提供亲缘关系的遗传背景材料。2.2.研究材料与方法研究材料与方法l研究材料：从新疆乌鲁木齐、木垒、霍城、尼勒克、唐布拉、阿尔泰、布尔津、小东沟、庙儿沟等地采

2、集野生石竹的种子，共计 10个种。l研究方法：DNA提取与纯化，PCR反应正交设计，电泳检测和指纹图谱构建DNA的提取与纯化的提取与纯化l采用改进的CTAB裂解-硅珠吸附法从新鲜的叶片中提取总DNA PCR反应的正交设计lSRAP-PCR反应：针对影响PCR反应Mg2+、dNTPs、引物和Taq聚合酶4个因素，选用L9(34)在3水平上进行实验。使用的引物组合为Me6/Em1。L9(34)设计表见表:组合编号 Mg2+(mmol/L)引物(mol/L)Taq酶（U/L）dNTP（mmol/L）1234567891.51.51.52.02.02.02.52.52.50.150.250.350.1

3、50.250.350.150.250.350.51.01.51.01.50.51.50.51.00.150.200.250.250.150.200.200.250.15lISSR-PCR反应：针对影响PCR反应Mg2+、dNTPs、引物和Taq聚合酶4个因素，选用 L9(34)在3水平上进行实验。使用的引物编 号为855。L9(34)设计表见表 :组合编号 Mg2+(mmol/L)引物(mol/L)Taq酶（U/L）dNTP（mmol/L）1234567891.251.251.251.751.751.752.252.252.250.40.60.80.40.60.80.40.60.80.51.0

4、1.51.01.50.51.50.51.00.3250.3750.4250.4250.3250.3750.3750.4250.325电泳检测电泳检测lISSR琼脂糖凝胶检测lSRAP聚丙烯酰胺凝胶检测指纹图谱的构建位点统计法：根据每对引物生成带型间的差别直接对带型进行分类编号，可得到每个种的带型编号。一个种的DNA经过不同引物扩增后，将获得一系列带型编号，按照固定的引物序列，串联各带型编号,形成一组数据。将这些图谱转换为由 1 和0 组成的字串，构成数字指纹图谱。3.结果分析l正交实验结果与分析l指纹图谱的构建正交实验结果与分析lSRAP-PCR反应：选取Me6/Em1作为扩增引物，以同一个种

5、不同家系的4个DNA进行扩增，电泳图如图：M 1 2 3 4 5 6 7 8 9根据电泳图，经过极差分析可知：SRAP-PCR反应中，对反应影响最大的是Mg2+,引物，之后dNTP,最后是Taq酶。4个组分的最佳反应水平为：Mg2+2.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L、引物0.25mol/L、Taq酶为1.0U。ISSR反应：选取855作为扩增引物，以同一个种不同家系的4个DNA进行扩增，电泳图如图：M 1 2 3 4 5 6 7 8 9根据电泳图，经过极差分析可知：ISSR-PCR反应中，对反应影响最大的是Mg2+、dNTP、之后是引物，最后是Taq酶。最佳水平为：Mg2+1.2

6、5mmol/L、dNTP 0.425mmol/L、引物0.8mol/L、Taq酶为0.5U。指纹图谱构建lSRAP数字指纹图谱材料编号Me3/Em12Me3/Em14Me8/Em14Me8/Em91234567891010011010010011001100100111001001100011010001100000110010100101001010011111100110110100000110011000000100000111000000010001000100100101111000010100001110000111100111101100010001110110101011011

7、0011111100110101000100001011100010100000011011100101001110101101001111001000001ISSR数字指纹图谱材料编号82684286487882712345678910 010101000100000100011001010010110000010000010000000100010001 10011111101010100111101000011011001010110111101011001101011011010100101000010100 00101101000001101000101110001000001000

8、00100010010101000000000100011100 001101110010111001100111111000100011000111000001100101101001 001000001000100011110111010110100110010111010110010010001100 4.讨论l分子标记的体系优化：利用正交验直观分析方法，能迅速获得满意的试验结果，而且具有试验规模小，节省人力物力 的优点。但该方法亦有一定的局限性，如对试验结果本身优劣的判断带有主观上的成分，故选出的组合不一定是最优的。l指纹图谱构建：通过两种分子标记的在有效引物比例、扩增出条带的稳定性和清晰度、指纹图谱的种间鉴别力 等方面的对比，可以证实SRAP标记优于ISSR标记。请各位老师批评指正!