基因工程的基本工具和操作程序.ppt
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1、高中生物复习课件高中生物复习课件卉原中学卉原中学 王廷杰王廷杰选修三选修三 现代生物科技专题现代生物科技专题异想天开异想天开第一讲第一讲 基因工程的基本工具和操作程序基因工程的基本工具和操作程序【考【考纲纲解解读读】考点考点考考纲纲要求要求考考查查角度角度基因工程的基因工程的诞诞生生基因工程的理基因工程的理论论基基础础及技及技术术支持;支持;基因工程的三大基本工具的特点及作用。基因工程的三大基本工具的特点及作用。基因工程的基因工程的原理及技原理及技术术基因工程的操作步基因工程的操作步骤骤及原理,有关概念的考及原理,有关概念的考查查;设计设计某一某一转转基因生物的培育基因生物的培育过过程,具体程
2、,具体到目的基因的到目的基因的获获取方式、基因表达取方式、基因表达载载体的构体的构建方法、基因建方法、基因检测检测与与鉴鉴定方法。定方法。一、基因工程的诞生:一、基因工程的诞生:基因工程又叫做基因工程又叫做DNADNA重组技术重组技术。是指按照人们的愿。是指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过望,进行严格的设计,并通过体外体外DNADNA重组技术重组技术和和转基转基因因等技术,赋予生物以新的等技术,赋予生物以新的遗传特性遗传特性,从而创造出更,从而创造出更符合人们需要的符合人们需要的新的生物类型和生物产品新的生物类型和生物产品。别名别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程
3、基本过程结果结果实质实质实例实例生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达DNADNA重组技术重组技术生产人类需要生物类型和生物产品生产人类需要生物类型和生物产品基因重组基因重组(定向)定向)我国科学家培育出的转基因抗虫棉我国科学家培育出的转基因抗虫棉科技探索之路科技探索之路基础理论和技术的发展催生了基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程1、基础理论突破:、基础理论突破:DNADNA是遗传物质的证据是遗传物质的证据 DNA DNA双螺旋结构模型的提出双螺旋结构模型的提出 中心法则的确立中心法则的确立 遗传密码的破译遗传密码的破译2、技术发明支
4、持:、技术发明支持:基因转移载体的发现基因转移载体的发现 工具酶的发现工具酶的发现 DNA DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明 DNA DNA体外重组的实现体外重组的实现 重组重组DNADNA表达实验的成功表达实验的成功 第一例转基因动物的问世第一例转基因动物的问世 PCR PCR技术的发明技术的发明二、二、DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具工欲善其事,必先利其器工欲善其事,必先利其器分子手术刀:分子手术刀:限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶分子缝合针:分子缝合针:DNA连接酶连接酶分子运输车:分子运输车:载体载体1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶分子手术刀分子手术刀 限
5、制性核酸内切酶简称限制性核酸内切酶简称限制酶限制酶,主要是从,主要是从原核生原核生物物 中分离纯化出来的。如:中分离纯化出来的。如:EcoR、Sma等。等。限制酶能够识别限制酶能够识别双链双链DNA分子的某些特定分子的某些特定核苷酸核苷酸序列序列,并且使每一条链中特定部位的两个,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸核苷酸之间的之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由 6 个核苷酸组成,如:个核苷酸组成,如:EcoR、Sma等。也有少数限制酶的识别序列由等。也有少数限制酶的识别序列由4、5或或8 个核苷酸组成。个核苷酸组成。经限制酶切割产生的经限制酶
6、切割产生的DNA片段末端通常有片段末端通常有粘性末粘性末端端和和平末端平末端两种形式。两种形式。限制酶的识别序列:限制酶的识别序列:大肠杆菌中的一种限制酶大肠杆菌中的一种限制酶(ECOR)能够能够专一识别专一识别GAATTC序列,并在序列,并在G和和A之间将这段序列切开。之间将这段序列切开。平末端平末端平末端平末端限制酶的功能限制酶的功能黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端GCTTAAAATTCGECORCGGGCCCCCGGGSmaSma能够识别能够识别CCCGGG序列,并在序列,并在C和和G之间切开。之间切开。寻根问底寻根问底:你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是你能推测限制酶存在于原核生物
7、中的作用是是什么吗?是什么吗?原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵的入侵,但生物在长期的进化过程中形成了一套完善但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,以防止外来病原物的侵害。的防御机制,以防止外来病原物的侵害。限限制酶就是细菌的一种防御性工具制酶就是细菌的一种防御性工具,当外源,当外源DNA侵入时,会利用限制酶侵入时,会利用限制酶将外源将外源DNA切割切割掉,以保证自身的安全。所以,限制酶在原掉,以保证自身的安全。所以,限制酶在原核生物中主要起到核生物中主要起到切割外源切割外源DNA、使之失效、使之失效,从而达到从而达到保护自身保护自身的目的。的目的。如果把两种
8、来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来用同一种限制酶来切割,会怎样呢?切割,会怎样呢?要获得某个目的基因须要用限制酶切几个切口?要获得某个目的基因须要用限制酶切几个切口?可产生几个黏性末端?一个目的基因有几个黏性可产生几个黏性末端?一个目的基因有几个黏性末端?末端?把两者的黏性末端通过碱基配对黏合起来,把两者的黏性末端通过碱基配对黏合起来,这样这样就真的合成重组的就真的合成重组的DNA分子了分子了?限制性内切酶切割的部位是哪里?限制性内切酶切割的部位是哪里?要切两个切口要切两个切口会产生相同的黏性末端会产生相同的黏性末端实际还不够,还需要实际还不够,还需要DNADNA连接酶进行连
9、接。连接酶进行连接。脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键思考思考产生四个黏性末端产生四个黏性末端两个两个DNADNA连接酶连接酶2、DNA连接酶连接酶分子缝合针分子缝合针 连接连接DNA两条链骨架上的缺口,形成两条链骨架上的缺口,形成 磷酸二酯键磷酸二酯键 。GCTTAAAATTCGDNA的结构的结构CATGCATGCATGCATG氢键氢键磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA(水解)(水解)酶酶解旋酶解旋酶限制酶限制酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同相同点点寻根问底寻根问底比较比
10、较DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶聚合酶 只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上,接到已有的核酸片段上,形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键 在在两个两个DNADNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 以以一条一条DNADNA链为模板链为模板,将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链 将将DNADNA双链上的双链上的两两个缺口同时连接个缺口同时连接起来,起来,不需要模板不需要模板3、基因进入受体细胞的载体、基因进入受体细胞的载体分子运
11、输车分子运输车(1)载体的作用:)载体的作用:将外源基因送入受体细胞将外源基因送入受体细胞(2)载体的种类:)载体的种类:质粒质粒噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物动、植物病毒动、植物病毒(3)质粒:)质粒:是一种是一种 裸露裸露的、结构简单、独立于细菌的、结构简单、独立于细菌 拟核拟核DNA DNA 以以外的,并具有外的,并具有自我复制自我复制 能力的很小的能力的很小的 双链环状双链环状DNA DNA 分分子。子。大肠杆菌质粒的特点:大肠杆菌质粒的特点:质质 粒粒 有有有有复制原点复制原点,能,能,能,能携带着插入的目的基携带着插入的目的基携带着插入的目的基携带着插入的目的基因一起复制,使因一起复
12、制,使因一起复制,使因一起复制,使目的目的基因扩增基因扩增。有有有有切割位点切割位点,可,可,可,可供供供供外源基因插入外源基因插入。有有有有标记基因标记基因,可,可,可,可用于用于用于用于鉴定和选择鉴定和选择。载体应具备的条件:载体应具备的条件:1、有切割位点有切割位点供外源供外源DNA片段片段(基因基因)插插入。限制酶的切点所处的位置,还必须是在入。限制酶的切点所处的位置,还必须是在质粒本身需要的基因片段之外。质粒本身需要的基因片段之外。2、能自我复制能自我复制提供大量的目的基因。提供大量的目的基因。3、有标记基因有标记基因供重组供重组DNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。4、载体载体DNA必
13、需是安全的必需是安全的不能被受体细不能被受体细胞清除,不能伤害受体细胞,也不能进入到胞清除,不能伤害受体细胞,也不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。除受体细胞外的其他生物细胞中去。5、载体载体DNA分子大小应适合分子大小应适合以便提取和以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作。在体外进行操作,太大就不便操作。基因工程的基本工具基因工程的基本工具分子手术刀:分子手术刀:限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶分子缝合针:分子缝合针:DNA连接酶连接酶分子运输车:分子运输车:载体载体三、基因工程的基本操作程序三、基因工程的基本操作程序vv目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取vv基
14、因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建vv将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞vv目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定基因操作基因操作“四步曲四步曲”1、目的基因的获取、目的基因的获取(1)概念:目的基因是人们所)概念:目的基因是人们所需要转移或改造需要转移或改造的的基因,主要是指基因,主要是指编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因,也可以是一,也可以是一些些具有调控作用的因子具有调控作用的因子。如如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,还有,还有植物的抗植物的
15、抗病(抗病毒、抗细菌)基因病(抗病毒、抗细菌)基因、种子贮藏蛋白的基种子贮藏蛋白的基因因,以及,以及人的胰岛素基因人的胰岛素基因、干扰素基因干扰素基因等。等。(2)获取方法:)获取方法:l从基因文库中获取从基因文库中获取l利用利用PCR技术扩增技术扩增l人工合成人工合成即:将需要的基因从供体生物细胞内提取出来即:将需要的基因从供体生物细胞内提取出来自然界自然界人工人工从基因文库获取目的基因从基因文库获取目的基因基因基因文库文库基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种
16、生物的不同受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库。基因,称为基因文库。如:如:cDNAcDNA文库文库基因文库的构建基因文库的构建(1 1)基因组文库的构建)基因组文库的构建)基因组文库的构建)基因组文库的构建提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当的用适当的限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库(每个受体菌含有一段不同的(每个受体菌含有一段不同的DNA片段)片段)(2 2)cDNAcDNA文库的构建文库的构建文库的构建文库的构建mRNAmRNA反转录形成反转录形成反转录形成反转录形成
17、核酸酶核酸酶HDNA聚合酶聚合酶与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群逆转录酶逆转录酶mRNA杂交双链杂交双链单链单链DNA双链双链DNA该生物的该生物的cDNA文库文库推测推测通过通过DNA合成仪人工直接合成目的基因合成仪人工直接合成目的基因DNA合成仪合成仪蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质的的的的氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸序列序列序列序列mRANmRAN的的的的核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸序列序列序列序列基因基因基因基因DNADNA的的的的核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸序列序列序列序列目目目目的的的的基基基基因因因因 当基因比较小、蛋白当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测质的氨基酸序列可以测得或核苷酸
18、序列已知时,得或核苷酸序列已知时,可采用此种方法。可采用此种方法。推测推测合成合成 总 结限制酶切割反转录利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR(多聚酶链式反应)(多聚酶链式反应)技术技术(1)概念:)概念:PCRPCR是多聚酶链式反应(是多聚酶链式反应(polymerase chain polymerase chain reactionreaction)的缩写)的缩写,它是利用它是利用DNADNA双链复制双链复制的原理,将基因的核苷酸的原理,将基因的核苷酸序列不断的加以复制,使其数量呈序列不断的加以复制,使其数量呈指数指数方式增加。因为整个过程是方式增加。因为整个过程是在在体外
19、体外进行,所以又叫做体外进行,所以又叫做体外DNADNA扩增技术。扩增技术。高温变性高温变性(9095)低温退火低温退火(5560)中温延伸中温延伸(7075)多次重复多次重复(2 2)过程:)过程:)过程:)过程:以以指数形式(指数形式(2n)扩增。扩增。(3)特点:)特点:PCR技术的过程技术的过程DNA变性变性:(:(90-9590-95):双链):双链DNA受热后,受热后,氢键氢键断裂,断裂,形成单链形成单链DNADNA。退火退火:(:(复性复性55-6055-60):系统温度降低,引物与):系统温度降低,引物与DNA单链相应互补序列结合,形成局部单链相应互补序列结合,形成局部双链双链
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