基因工程的主要技术与原理-核酸分离电泳.ppt

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1、生物技术专业核心课程生物技术专业核心课程基基 因因 工工 程程F F F F 基因的化学合成基因的化学合成基因的化学合成基因的化学合成D D D D 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术 A A A A 核酸的分离和纯化核酸的分离和纯化核酸的分离和纯化核酸的分离和纯化B B B B 核酸电泳核酸电泳核酸电泳核酸电泳3.基因工程的主要技术及原理基因工程的主要技术及原理C PCRC PCRC PCRC PCR技术技术技术技术E DNAE DNAE DNAE DNA核苷酸序列分析核苷酸序列分析核苷酸序列分析核苷酸序列分析第一节第一节 核酸的分离和纯化核酸的分离和纯化一、一、DNADNA的

2、分离、检测和纯化的分离、检测和纯化vDNADNA的来源及用途的来源及用途 染色体染色体DNA:DNA:分子巨大，分子巨大，1000Kb-101000Kb-106 6KbKb。是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料；是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料；也可用于构建染色体载体和染色体基因整合平台。也可用于构建染色体载体和染色体基因整合平台。(IsolationandPurificationofnucleicacid)人人3x106kb植物植物2x1051x108kb果蝇果蝇1.28x105kb酵母酵母15,000kb细菌细菌33004200kb天花病毒天花病毒288kb痘病毒痘病毒19

3、6kb质体质体几几100以上以上kb染色体染色体DNADNA比较比较细胞器细胞器DNA:DNA:主要指线粒体主要指线粒体DNADNA和叶绿体和叶绿体DNA,DNA,是真核是真核 生物所特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸生物所特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸 作用和光合作用相关的基因。可用于作用和光合作用相关的基因。可用于分离目的基因分离目的基因 和和构建克隆载体构建克隆载体。双子叶植物双子叶植物121121（菠菜）（菠菜）-154kb-154kb（豌豆）（豌豆）单子叶植物单子叶植物151151（玉米）（玉米）-182kb-182kb（浮萍）（浮萍）藻类藻类132132（裸藻）（裸藻）

4、-191kb-191kb（衣藻）（衣藻）叶绿体叶绿体DNADNA比较比较藻类藻类线状线状15kb15kb酵母酵母环状环状19-78kb19-78kb植物植物环状环状100-150kb100-150kb动物动物(扁虫到人扁虫到人)环状环状15-18kb15-18kb锥虫锥虫网状网状6000kb(6000kb(幼体幼体)短膜虫短膜虫网状网状30,000kb(30,000kb(幼体幼体)线粒体线粒体DNADNA比较比较病毒和噬菌体病毒和噬菌体DNA:DNA:主要用于主要用于构建基因克隆载体，构建基因克隆载体，可承载较大片段的外源可承载较大片段的外源DNADNA。质粒质粒DNA:DNA:为染色体外遗传

5、物质；分子大小为染色体外遗传物质；分子大小1Kb-1Kb-几百几百KbKb不等，具有复制起始位点，可自我复制。主要用于不等，具有复制起始位点，可自我复制。主要用于构建基因克隆载体构建基因克隆载体。vDNADNA提取的一般程序提取的一般程序供体细胞培养供体细胞培养收集收集(菌体菌体)细胞细胞细胞破碎细胞破碎分离总分离总DNA细胞器细胞器DNA的的分离、纯化分离、纯化总总DNA的抽的抽提、纯化提、纯化分离细胞器分离细胞器1.1.化学法化学法：细胞裂解方法细胞裂解方法1)酶解酶解:利用酶在温和的条件下，有选择性地破坏细利用酶在温和的条件下，有选择性地破坏细胞膜系统胞膜系统。溶菌酶、溶壁酶、纤维素酶、

6、果胶酶等。溶菌酶、溶壁酶、纤维素酶、果胶酶等。2)增溶：利用表面活性剂的增溶作用破坏细胞膜系统增溶：利用表面活性剂的增溶作用破坏细胞膜系统。常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基、十六烷基三甲基溴化铵三甲基溴化铵(CTAB)。2.2.机械法：机械法：1)压力剪切法：压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌压力机，酵母细胞，细菌2)匀浆法：搅切器匀浆法：搅切器(blender)，混合器，混合器(mixer)，3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球同时致冷，固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末在未融熔前用研杵磨成粉末4

7、)超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行 细胞破碎，效率更高细胞破碎，效率更高3.3.其它方法：其它方法：1)煮沸法：煮沸法：2)冻融法：冻融法：3)干燥法：干燥法：v植物总植物总DNADNA的提取的提取一般地说，总一般地说，总DNADNA主要是指基因组主要是指基因组DNA(genomicDNA(genomic DNA),DNA),即细胞核内的染色体即细胞核内的染色体DNADNA分子。分子。核核DNADNA分分子子呈呈极极不不对对称称的的线线状状结结构构,一一条条染染色色体体为为一一个个 DNADNA分分子子。高高等等植植物物核核DNADNA大大约约含

8、含有有10109 9bpbp，其其长长度度与与直直径径的的比比例例极极不不对对称称，使使其其对对机机械械力力十十分分敏敏感感。很很难难分分离离出出它它的的完完整整分分子子。分分离离纯纯化化过过程程中中，DNADNA分分子子的的断断裂裂是是很难避免的。很难避免的。为了尽可能获得大分子量的为了尽可能获得大分子量的DNADNA，一般采用去污一般采用去污 剂温和处理法，对于细胞破碎较困难的植物材料，剂温和处理法，对于细胞破碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶可以辅加蛋白酶K K，在酶的存在下共同破碎细胞。在酶的存在下共同破碎细胞。v植物总的提取方法从提取原理上主要有以下两种：植物总的提取方法从提取原理上

9、主要有以下两种：对于基因组文库的构建及对于基因组文库的构建及SouthernSouthern杂交，应尽量杂交，应尽量 使用片段较长的使用片段较长的DNADNA分子。分子。CTABCTAB法法(十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵)SDSSDS法法(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠)1.CTAB1.CTAB法原理法原理CTAB高盐溶液高盐溶液(0.7mol/L NaCl)CTABCTABCTAB核酸核酸蛋白质蛋白质多糖多糖低盐溶液低盐溶液(0.3mol/L NaCl)CTAB蛋白质蛋白质CTAB多糖多糖上清液上清液沉淀沉淀CTAB核酸核酸CTAB核酸核酸CTAB核酸核酸CTAB核酸核酸核酸核酸核

10、酸核酸核酸核酸核酸核酸乙醇或异丙醇溶液乙醇或异丙醇溶液核酸核酸上清液上清液沉淀沉淀CTAB(cetyltrimethylCTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide,ammonium bromide,十六烷十六烷基三乙基溴化铵基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，能是一种去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物；与核酸形成复合物；然后将然后将CTABCTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，再加入乙醇使核酸沉淀，CTABCTAB能溶于乙醇。能溶于乙醇。在高盐溶液（在高盐溶液（0.70.7mol/L mol

11、/L NaClNaCl）中是可溶的，当降中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（低溶液盐浓度到一定程度（0.30.3mol/L mol/L NaClNaCl）时从溶时从溶液中沉淀，通过离心就可将液中沉淀，通过离心就可将CTABCTAB与核酸的复合物同白与核酸的复合物同白质、多糖类物质分开；质、多糖类物质分开；1.CTAB1.CTAB法原理法原理2.SDS2.SDS法原理法原理其原理是利用高浓度的其原理是利用高浓度的SDSSDS（十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠在较高温度（在较高温度（5555-65-650 0C C）条件下裂解细胞，使染条件下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸；色体离析

12、、蛋白质变性，释放出核酸；在低温、高盐条件下，使蛋白质及多糖沉淀在低温、高盐条件下，使蛋白质及多糖沉淀(常是加入常是加入5 5mol/Lmol/L的乙酸钾冰浴，使乙酸钾与的乙酸钾冰浴，使乙酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物蛋白质及多糖结合成不溶物)。离心除去沉淀后。上清液中的离心除去沉淀后。上清液中的DNADNA进行反复进行反复抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的DNADNA。FSDSSDS法操作简单、温和，也可提取到高分法操作简单、温和，也可提取到高分子量的子量的DNADNA，但所得产物含糖类杂质较多。但所得产物含糖类杂质较多。FCTABCTAB法的最大优点是能很

13、好地去除糖类杂法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先使用。质，对于含糖较高的材料可优先使用。3.CTAB3.CTAB与与SDSSDS4.4.基因组总基因组总DNADNA法提取程序法提取程序1)1)液氮研磨材料成粉末，置于离心管中液氮研磨材料成粉末，置于离心管中再加入适量再加入适量2CTAB2CTAB提取液，充分混匀，提取液，充分混匀，6565水浴水浴1hr；2)42)4，12000 r/m12000 r/m，离心，离心10 min10 min，吸，吸取上清液转入新的离心管；取上清液转入新的离心管；3)3)加入等体积的酚加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，氯仿，充分混匀，静置静

14、置5min5min后于后于44、12000 r/min12000 r/min，离，离心心10min10min；裂解细胞膜裂解细胞膜沉淀材料残渣沉淀材料残渣变性、沉淀变性、沉淀 蛋白质蛋白质5)5)将上清液转入另一离心管，加入等体积将上清液转入另一离心管，加入等体积异丙醇（或两倍体积冷乙醇），混匀，冰异丙醇（或两倍体积冷乙醇），混匀，冰浴浴20-30 min20-30 min，沉淀，沉淀DNADNA；6)6)挑出絮状挑出絮状DNADNA沉淀，沉淀，70%70%乙醇中洗涤乙醇中洗涤2 2次；次；7)7)无水乙醇洗涤无水乙醇洗涤1 1次；次；8)8)风干后，加适量风干后，加适量TETE缓冲液或无菌双

15、蒸水缓冲液或无菌双蒸水溶解溶解DNADNA，-20-20贮存备用。贮存备用。4)4)将上清液转入另一离心管，加入等体积将上清液转入另一离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，氯仿，充分混匀，44、12000 r/min12000 r/min，离，离心心10 min10 min；进一步变性、沉淀进一步变性、沉淀蛋白质，清除残余蛋白质，清除残余苯酚苯酚沉淀沉淀DNADNA洗涤、干燥洗涤、干燥DNADNA溶解、保存溶解、保存DNADNA电泳结果电泳结果v大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒DNADNA的提取的提取F克隆载体分子及装载于载体中的克隆化克隆载体分子及装载于载体中的克隆化基因，大多是以质粒的形式保存在大肠杆

16、基因，大多是以质粒的形式保存在大肠杆菌中，因此，许多基因操作都离不开大肠菌中，因此，许多基因操作都离不开大肠杆菌质粒杆菌质粒DNADNA的提取，其步骤主要有的提取，其步骤主要有3 3个：个：细菌的培养细菌的培养细菌的收集和裂解细菌的收集和裂解质粒质粒DNADNA的分离和纯化的分离和纯化碱裂解法提取碱裂解法提取E.coli质粒质粒DNADNA程序及原理程序及原理1.1.将菌落转接入约将菌落转接入约5ml5ml含相应抗生素的含相应抗生素的LBLB液体液体培养基中，培养基中，3737恒温振摇，培养过夜恒温振摇，培养过夜(12hr)(12hr)；2.2.取取1.5 ml1.5 ml培养物转入微量离心管

17、中，培养物转入微量离心管中，44，12000 r/min12000 r/min离心离心30 sec30 sec，倒掉培养液，尽可，倒掉培养液，尽可能清除残余液能清除残余液(可重复可重复2-32-3次次)；3.3.弃培养液，使细菌尽可能干燥；弃培养液，使细菌尽可能干燥；细菌的培养细菌的培养菌体的收集菌体的收集4.4.将细菌沉淀重悬于将细菌沉淀重悬于200l200l冰预冷的溶液冰预冷的溶液I I中，中，剧烈振荡；剧烈振荡；5.5.加入加入400l400l新配置的溶液新配置的溶液IIII，快速颠倒离心，快速颠倒离心管数次，混匀后，将离心管置于冰上管数次，混匀后，将离心管置于冰上3-5 min3-5

18、min；溶液溶液I I：50mM50mM葡萄糖葡萄糖/25mM Tris-Cl/10/25mM Tris-Cl/10 mMmM EDTA EDTA，pH 8.0pH 8.0；悬浮菌体悬浮菌体溶液溶液IIII：0.2N NaOH/10.2N NaOH/1%SDS%SDS；裂解菌体细胞裂解菌体细胞F充分悬浮，充分悬浮，避免结块。避免结块。F控制时间；控制时间；F操作柔和。操作柔和。6.6.加入加入300l300l冰预冷的溶液冰预冷的溶液IIIIII，后温和振荡，后温和振荡1010秒钟，混匀后，置于冰上秒钟，混匀后，置于冰上3-5min3-5min；溶液溶液IIIIII：3 M 3 M 醋酸钾醋酸钾

19、 /2 M/2 M 醋酸醋酸 质粒质粒DNADNA的分离的分离F中和中和NaOHNaOH；F沉淀蛋白质和沉淀蛋白质和 基因组基因组DNADNA。7.47.4，12000 r/min12000 r/min离心离心5min5min，将上清转至，将上清转至另一离心管中；另一离心管中；8.8.加入等体积的酚加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀，氯仿，振荡混匀，44，12000r/min12000r/min离心离心5min5min，将上清转至另一离心，将上清转至另一离心管中；管中；9.9.加入等体积的氯仿混匀，加入等体积的氯仿混匀，44，12000r/min12000r/min离心离心5min5min，将上清

20、转至另一离心管中；，将上清转至另一离心管中；进一步变性、沉进一步变性、沉淀蛋白质淀蛋白质14.14.风干后，溶于风干后，溶于20-50lTE20-50lTE缓冲液或无菌缓冲液或无菌双蒸水中；双蒸水中；15.15.加入适量无加入适量无DNADNA酶的酶的RNase(20g/ml)RNase(20g/ml)，3737处理处理30min30min；16.16.琼脂糖凝胶电泳检测后，琼脂糖凝胶电泳检测后，-20-20贮存备用。贮存备用。沉淀、洗涤沉淀、洗涤DNADNAF也可用等体也可用等体积异丙醇沉淀积异丙醇沉淀质粒质粒DNADNA；10.10.加入加入2 2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，倍体积的无水乙

21、醇，轻轻混匀，置于冰上沉淀置于冰上沉淀DNADNA；11.411.4，12000 r/min12000 r/min离心离心15 min15 min；12.12.小心吸去上清，将离心管倒置于吸水纸小心吸去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使所有液体流出；上，使所有液体流出；13.70%13.70%乙醇洗涤乙醇洗涤DNADNA沉淀；沉淀；溶解备用溶解备用F消化消化RNA RNA F适度干燥；适度干燥；质粒质粒DNADNA电泳结果电泳结果1.1.共价闭合环状超螺旋共价闭合环状超螺旋(covalently closed circular DNA,ccc-DNA)超螺旋超螺旋线状分子线状分子3.3.开环螺旋

22、开环螺旋(open circular DNA,oc-DNA)2.2.线状线状DNA(linear DNA,l-DNA)开环螺旋开环螺旋二、二、RNARNA的分离和纯化的分离和纯化4一个典型的哺乳动物细胞约含一个典型的哺乳动物细胞约含1010-5-5ugRNAugRNA，其，其中，中，80-85%80-85%为为rRNA(28SrRNA(28S、18S18S和和5S5S三种三种)；其余；其余15-20%15-20%为各种低相对分子量为各种低相对分子量RNARNA，如，如tRNAtRNA、核内、核内小分子小分子RNARNA等，而等，而mRNAmRNA只占只占1-5%1-5%。4mRNAmRNA是单

23、链的，极易受到核酸酶的攻击而导致是单链的，极易受到核酸酶的攻击而导致降解。降解。对对RNARNA的操作要求比的操作要求比DNADNA更为严格。更为严格。（一）控制潜在的（一）控制潜在的RNARNA酶活性酶活性 2)2)解决办法：解决办法：1)1)RNaseRNase的特点：的特点：抗酸抗碱抗酸抗碱,具很广具很广pHpH作用范围作用范围;抗高温严寒抗高温严寒(0-65(0-65均具活性均具活性)；抗变性剂。；抗变性剂。湿热灭菌：湿热灭菌：一次性用品，如微量移液吸头一次性用品，如微量移液吸头(tip)(tip)、微、微 量离心管量离心管(eppendorfeppendorf tube)tube)等

24、，先用等，先用0.1%0.1%的焦磷酸二的焦磷酸二 乙酯乙酯(DEPC)(DEPC)处理过的水浸泡过夜后，处理过的水浸泡过夜后，121121湿热灭菌湿热灭菌 30min;30min;干热灭菌：干热灭菌：耐热器皿，如玻璃制品、研钵、镊子等，耐热器皿，如玻璃制品、研钵、镊子等，可在可在180-200180-200高温干热灭菌高温干热灭菌4hr4hr以上；以上；电泳用具：电泳用具：最好专用；用前洗涤剂清洗干净，再用最好专用；用前洗涤剂清洗干净，再用 3%H 3%H2 2O O2 2和和0.1%0.1%的的DEPCDEPC水浸泡后，冲洗干净方可使用。水浸泡后，冲洗干净方可使用。操作者防护：操作者防护：

25、实验过程中必须带手套，并常换手套，实验过程中必须带手套，并常换手套，尽量避免外源尽量避免外源RNaseRNase的污染；的污染；内源内源RNaseRNase：采用高温抽提，提取液中添加强蛋白质采用高温抽提，提取液中添加强蛋白质 变性剂，变性剂，RNaseRNase抑制剂，蛋白酶抑制剂，蛋白酶K K等。等。（二）（二）RNARNA的抽提和纯化的抽提和纯化 1)1)酚酚-异硫氰酸胍抽提法：异硫氰酸胍抽提法：异硫氰酸胍异硫氰酸胍(GIT)(GIT)与与b b-巯基乙醇共同作用可抑制巯基乙醇共同作用可抑制 RNaseRNase活性；活性；GITGIT与十二烷基肌氨酸钠共同作用可使蛋白质变与十二烷基肌氨

26、酸钠共同作用可使蛋白质变 性，从而释放性，从而释放RNARNA；在酸性条件下，在酸性条件下，DNADNA极少发生解离，而是同蛋白极少发生解离，而是同蛋白 质一起沉淀，质一起沉淀，RNARNA则保留在上清液中而得到分离；则保留在上清液中而得到分离；2)2)硅胶膜纯化法：硅胶膜纯化法：RNeasyRNeasy试剂盒由试剂盒由QiagenQiagen公司设计，其设计思路与公司设计，其设计思路与DNADNA纯化思路相似；纯化思路相似；当含有目的当含有目的RNARNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNARNA被吸附在硅胶膜上，从而与其它成分分开；被吸附在硅胶膜上，从而与其它成分分开

27、；在低盐浓度条件下，在低盐浓度条件下，RNARNA被洗脱液洗脱下来；被洗脱液洗脱下来；（三）（三）mRNAmRNA的纯化的纯化 NorthernNorthern杂交可以使用总杂交可以使用总RNA,RNA,而构建而构建cDNAcDNA文库文库 时，则必须得到纯化的时，则必须得到纯化的mRNAmRNA；亲和层析法分离亲和层析法分离mRNA:mRNA:利用真核生物利用真核生物mRNA3mRNA3端的端的 poly(Apoly(A)尾巴可被尾巴可被oligo(dToligo(dT)-)-纤维素吸附，已开纤维素吸附，已开 发出许多用于发出许多用于mRNAmRNA纯化的层析柱。纯化的层析柱。RNARNA电

28、泳结果电泳结果28S rRNA28S rRNA18S rRNA18S rRNA三、核酸的评价三、核酸的评价1.1.核酸纯度核酸纯度评价：评价：DNADNA样品样品：OD260/OD280=1.8 OD260/OD280=1.8 较较纯纯；OD260/OD2801.8 OD260/OD2801.8 可能有可能有RNARNA污染污染；OD260/OD2801.8 OD260/OD2802.0 OD260/OD2802.0 可能有异硫氰酸残存可能有异硫氰酸残存；OD260/OD2801.7 OD260/OD2801.7 有蛋白质或酚污染有蛋白质或酚污染 2.2.核酸核酸浓度估算：浓度估算：v当当OD

29、260OD2601 1时，时，F SSDNA=37g/ml SSDNA=37g/ml F dSDNAdSDNA=50g/ml=50g/mlF SSRNA=40g/ml SSRNA=40g/mlF 寡核苷酸浓度约为寡核苷酸浓度约为30g/ml 30g/ml(NucleicAcidGelElectrophoresis)第二节第二节 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳F优点：优点：（1 1）便于分离；）便于分离；（2 2）便于检测；）便于检测；（3 3）便于回收。）便于回收。核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化用于分离、鉴定和纯化DNADNA或或RN

30、ARNA片段；片段；电泳：带电物质在电场中向相反电极电泳：带电物质在电场中向相反电极 移动的现象称为电泳。移动的现象称为电泳。一、核酸凝胶电泳的基本原理一、核酸凝胶电泳的基本原理 核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；电极方向迁移；v因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、在凝因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。差异的核酸分子。电泳迁移率（或

31、迁移速度）与分子的摩擦系数成电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis4检测检测DNADNA是否真的存在，是否有降解现象，是否真的存在，是否有降解现象，DNADNA经经 限制性内切酶酶切后其产物的大小。目前最成熟限制性内切酶酶切后其产物的大小。目前最成熟 的检测的检测 DNA DNA 的技术是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖从的技术是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖从 海藻中提取的一种线状高聚物，在海藻中提取的一种线状高聚物，在0.7

32、%0.7%的琼脂糖的琼脂糖 浓度下，对浓度下，对0.80.8-10kb-10kb的的DNADNA有最佳的分离效果。有最佳的分离效果。（一）凝胶的制备及电泳（一）凝胶的制备及电泳琼脂糖分子式琼脂糖分子式琼脂糖琼脂糖(AgaroseAgarose)：是从红色海藻中提取的一种是从红色海藻中提取的一种 线状多糖高聚体。线状多糖高聚体。琼脂糖凝胶制作过程琼脂糖凝胶制作过程（二）（二）DNA的迁移速率决定因素的迁移速率决定因素双链双链DNADNA分子迁移的速率分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数与其碱基对数的常用对数近似成反比；近似成反比；5001000100005000同一分子：超螺旋环状同一分子：超螺

33、旋环状线状缺口环状。线状缺口环状。1.DNA1.DNA分子的大小和构象分子的大小和构象 2.2.琼脂糖浓度和种类琼脂糖浓度和种类 浓度越低，相同核酸浓度越低，相同核酸分子迁移越快；分子迁移越快；常见的有两种：标准常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；琼脂糖和低熔点琼脂糖；5000 不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/标准琼脂糖标准琼脂糖35-3835-3890-9590-95不同厂家生不同厂家生产的不同商产的不同商品其凝结温品其凝结温度和熔化温度和熔化温度有一定差度有一定差异异40-4240-4285-9085-90 高强度琼脂糖

34、高强度琼脂糖34-4334-4385-9585-95 修饰的低熔点修饰的低熔点/凝凝点琼脂糖点琼脂糖25-3525-3563-6563-6535356565 超低熔点超低熔点8-158-1540-4540-45 低黏性低熔点琼脂低黏性低熔点琼脂糖糖25-3025-3070703838858530307575不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离DNADNA片段的范围片段的范围浓浓度度（%）标标准准(kb)高强度高强度(kb)低熔点低熔点(kb)低黏度低溶低黏度低溶点点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.37

35、0.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.13.3.凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）插入双链）插入双链DNADNA造成其负电荷造成其负电荷 减少、刚性和长度增加。减少、刚性和长度增加。5.5.所用的电压所用的电压 低电压时低电压时DNADNA片段迁移率与所用的电压成正比；片段迁移率与所用的电压成正比；6.6.电泳缓冲液电泳缓冲液 常用的有常用的有TAETAE、TPETPE及及TBETBE。缓冲液缓冲液使用液使用液浓贮存液（每升）浓贮存液（每升）tris-乙酸乙

36、酸 （TAE）10.04mol/l tris-乙酸乙酸 50242g tris碱碱 0.001mol/l EDTA 57.1ml冰乙酸冰乙酸 100ml 0.5mol/l EDTA(ph8.0)tris-磷酸磷酸 （TPE）10.09mol/l tris-磷酸磷酸 1010g tris碱碱 0.002mol/l EDTA 15.5ml85%磷酸磷酸 （1.679g/ml）40ml 0.5mol/l EDTA(ph8.0)tris-硼酸硼酸 （TBE）0.50.045mol/l tris-硼酸硼酸 554g tris碱碱 0.001mol/l EDTATAETAE、TPETPE及及TBETBE电

37、泳缓冲液比较电泳缓冲液比较1 1）TAETAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2 2）TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3 3）双链线状）双链线状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中迁移快中迁移快10%10%；4 4）对于高分子质量的）对于高分子质量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或TPETPE，对于低分子质量的对于低分子质量的DNAD

38、NA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的中的电泳分辨率要好于电泳分辨率要好于TBETBE。（三）（三）凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液载样缓冲液：载样缓冲液：在上样到凝胶加样孔之前与在上样到凝胶加样孔之前与 待电泳的样品相混合的一种缓冲液。待电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：载样缓冲液有三个作用：F增加样品密度保证增加样品密度保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；F使样品带有颜色便于简化上样过程；使样品带有颜色便于简化上样过程；F可以指示电泳进程。可以指示电泳进程。66凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液类型类型 6 6缓冲液缓冲液贮存温度贮存

39、温度I I 0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝44 0.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰FFFF 40%(m/V)40%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液IIII 0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温 0.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰FFFF 15%Ficoll(Type400)15%Ficoll(Type400)水溶液水溶液IIIIII 0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝44 0.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰FFFF 30%30%甘油水溶液甘油水溶液IVIV 0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝44 40%(m/V)40%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液v指示剂指示剂:溴酚兰溴酚兰在碱性液体中

40、呈紫兰色，在不同浓度凝胶在碱性液体中呈紫兰色，在不同浓度凝胶中，迁移速度基本相同。在中，迁移速度基本相同。在0.6%0.6%、1%1%、1.4%1.4%和和2%2%琼脂琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb1Kb、0.6Kb0.6Kb、0.2Kb0.2Kb和和0.15Kb0.15Kb的双链线性的双链线性DNADNA片段大致相同。片段大致相同。二甲苯腈二甲苯腈的水溶液呈兰色，携带的电荷量比溴酚兰的水溶液呈兰色，携带的电荷量比溴酚兰少，迁移的速度比溴酚兰慢，它在少，迁移的速度比溴酚兰慢，它在1%1%和和1.4%1.4%琼脂糖中琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与

41、电泳时，其迁移速率分别与2Kb2Kb和和1.6Kb1.6Kb的双链线性的双链线性DNADNA大致相似。大致相似。（四）琼脂糖凝胶中（四）琼脂糖凝胶中DNA的检测的检测4通过染色通过染色,紫外灯下检测。紫外灯下检测。主要染料：主要染料：F溴化乙锭（溴化乙锭（ethidiumethidium bromide,EB bromide,EB）FSYBR GoldSYBR Gold1.1.凝胶的凝胶的EBEB染色染色EBEB的分子式的分子式EBEB的染色原理的染色原理F溴化乙锭是一溴化乙锭是一种具扁平分子的种具扁平分子的核酸染料，可以核酸染料，可以插入到插入到DNADNA或或RNARNA分子的碱基之间分子

42、的碱基之间v使用使用EBEB染色注意事项染色注意事项（1 1）EBEB被认为是一种被认为是一种强致癌物质强致癌物质（2 2）EBEB可用来检测单链或双链核酸可用来检测单链或双链核酸 （3 3）EBEB常用水配制成常用水配制成10 mg/ml10 mg/ml的贮存液，于室的贮存液，于室 温保存在温保存在棕色瓶棕色瓶或用或用铝箔铝箔包裹的瓶中，使包裹的瓶中，使 用终浓度为用终浓度为0.5g/ml0.5g/ml。（4 4）当要知道）当要知道DNADNA片段准确大小时，凝胶应在片段准确大小时，凝胶应在 无无EBEB情况下电泳，电泳结束后再用情况下电泳，电泳结束后再用EBEB染色。染色。2 2 凝胶凝胶

43、SYBR GoldSYBR Gold的染色的染色SYBR GoldSYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。是一种新型极敏感染料的商品名称。其与其与DNADNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号大增强荧光信号。（五）（五）凝胶中凝胶中DNA的成像的成像可以用透射或入射紫外光对可以用透射或入射紫外光对EBEB染色的凝胶成像，染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。图像可以直接输出到计算机观察。Gel Doc 2000 Systems and Accessories（六）（六）凝胶中凝胶中DNA的回收的回收现一般采用试剂盒回收。现一般采

44、用试剂盒回收。存在的主要问题：存在的主要问题：F不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA F不能有效回收少量不能有效回收少量DNADNA 二、二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE在在四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)催化催化过硫酸铵过硫酸铵还原产生的还原产生的自由基的存在下，自由基的存在下，丙烯酰胺单体丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成的乙烯基聚合形成聚聚丙烯酰胺丙烯酰胺的线状长链。的线状长链。（一）（一）聚丙烯酰胺凝胶的本质聚丙烯酰胺凝胶的本质在双功能交联剂如在双功能交联剂如N N，N

45、N-亚甲双丙烯酰胺的参与亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状三维带状网格结构。网格结构。网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度剂的浓度。CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺）CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亚甲双丙烯酰胺）（二）（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳种类聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1.1.变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶用于单链用于单链DNADNA片段的分离或纯化、片段的分离或纯化、DNADNA测序测序反应等。反应等。变性的变性

46、的DNADNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关，只与分子大小有关。碱基组成及序列完全无关，只与分子大小有关。2.2.非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶F迁移率受其碱基组成和序列的影响。迁移率受其碱基组成和序列的影响。F用于双链用于双链DNADNA片段的分离和纯化、制片段的分离和纯化、制 备高纯度的备高纯度的DNADNA片段。片段。（三）（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围有效分离范围（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝溴酚蓝3.5100020004601005.010

47、0500260658.0604001604512.050200702015.025150601520.051004512注注:N,N-:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;1/30;聚丙烯酰胺凝胶装置聚丙烯酰胺凝胶装置三、三、脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresisPFGE19841984年，年，SchwartzSchwartz和和CantorCantor发明发明（一）（一）PFGE 工作的基本原理工作的基本原理该法可分离长至该法可分离长至107bp的的DNADNA分子。严格说来，分子。严格说来，

48、应叫交替电场凝胶电泳。应叫交替电场凝胶电泳。这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。进行的。DNADNA分子在交替变换方向的电场中作出分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。反应所需的时间取决于它的大小。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图（二）（二）PEGE类型类型垂直脉冲场电泳系统垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field)(vertical pulsed field)场翻转系统场翻转系统(field inversion)(field inversion)旋转胶系统旋转胶系统(rotat

49、ing gel)(rotating gel)箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous(contour-clamped homogeneous electric field)electric field)A-+AB-+B垂直或横向交变系统垂直或横向交变系统场翻转系统场翻转系统箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统旋转胶系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+（三）（三）影响分辨率的因素影响分辨率的因素1.1.脉冲时间脉冲时间(0.1s-1000s)(0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。大

50、分子，减少脉冲时间分离较小分子。2.2.电压：电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。会导致较小片段泳动的紊乱。3.3.电场夹角：电场夹角：电场方向的夹角常为电场方向的夹角常为1100-1200，研究证实研究证实900夹角也非常有效的。夹角也非常有效的。4.4.温度：温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGEPFGE一般应在一般应在44进行。较高的温度进行。较高的温度DNADNA泳动较快；但泳动较快；但是较高的温度也引起