基因工程-工具酶.ppt

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1、工具酶工具酶第四章第四章 工具酶工具酶工具酶工具酶基因工程技术中能用于基因工程技术中能用于DNA和和RNA的合成、的合成、连接、切割和修饰的各种酶。连接、切割和修饰的各种酶。包括：包括：限制酶限制酶,核酸酶核酸酶.聚合酶聚合酶,连接酶连接酶,激酶激酶,磷酸酶磷酸酶,第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶（RestrictionEndonuclease）一一.细菌的细菌的限制一修饰现象限制一修饰现象被发现被发现瑞士塞尔生物研究中心瑞士塞尔生物研究中心Arber提出提出限制一修饰理论限制一修饰理论：核酸内切酶降解核酸内切酶降解细菌外源细菌外源DNA,修饰酶保护自身修饰酶保护自身DNAArber首次

2、从首次从E.ColiB菌株中分离出菌株中分离出型限制酶型限制酶EcoB美美Hopkings大学大学H.Smith从流感嗜血菌中分离从流感嗜血菌中分离型型限制酶限制酶Arber,Smith获得获得1978年年Nobel奖奖二二.限制酶系统分类和命名限制酶系统分类和命名1985年后大量限制酶被发现，已从年后大量限制酶被发现，已从350多种微生多种微生物中发现物中发现2000多种限制酶，识别多种限制酶，识别108种不同的特定种不同的特定序列序列限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类型型:特异识别、随机切割特异识别、随机切割型：型：特异识别、同点切割特异识别、同点切割型：特异识别、异地切割型：特异识别、

3、异地切割通常所指的限制酶即通常所指的限制酶即类酶类酶限制酶特性比较限制酶特性比较 I型 II型 III型限制与修饰由限制与修饰由同一酶承担同一酶承担是是否否是是酶反应辅助因子酶反应辅助因子ATP.mg+SAMmg+ATP.mg+SAM识别位点特性识别位点特性/4-6bp回文对称回文对称/切割位点切割位点距离距离1kb识别点中识别点中距距3 端端24-26bp举例举例 EcoBBamHIEcoPL识别位点识别位点TGAN8TGCTGGATTCAGACC克隆工作中用途克隆工作中用途 无无有有无无SAM:硫一腺苷甲硫氨酸硫一腺苷甲硫氨酸三三.系统命名法系统命名法限制性内切酶的命名方法限制性内切酶的命

4、名方法属名属名种种变种变种序数序数1字母字母2字母字母1字母字母(EcoRI)EcoRI(HindIII)HindIII(BamHI)BamHI四四.一般限制酶的识别特点一般限制酶的识别特点1.大多数是严格的识别顺序，少数可变大多数是严格的识别顺序，少数可变2.识别顺序的碱基数一般为识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，少数识别更长3.多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位多数识别位点具有旋转对称性，少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性点在切割位点之外，具旋转对称性4bpHpaC CGGHaeGG CC5bp Ava G GWCCEcoR CCWGG6bp BamHG GAT

5、TCSmaCCC GGG11bp Bg1GCCNNNN NGGC12bp BstXCCANNNNN NTGCN=A,T,G,C五五.限制酶的切割末端限制酶的切割末端5 粘端粘端（EcoRI）3 粘端粘端（PstI）平端平端（Sma I）六六.限制酶产生的末端的连接限制酶产生的末端的连接1.匹配粘端匹配粘端:直接连接直接连接2.平末端平末端:万能连接万能连接3.不匹配粘端：不匹配粘端：S1Nuclease切去突出端切去突出端或或Klenow补平补平七七.识别位点与切割方式之间的关系识别位点与切割方式之间的关系1.识别不同，切割不同识别不同，切割不同eg:BamHIEcoRI-GGATC C-A

6、GATCT-C CTAGG-TCTAG A-2.识别不同，切割产生末端相同识别不同，切割产生末端相同(同尾酶同尾酶)eg:BamHIBg1-A GATCT-G GATCC-TCTAG A-CCTAG G3.识别相同，切割不同识别相同，切割不同eg:SmaIXmaI-CCC GGG-C CCGG-GGG CCC-GGGCC C-4识别相同，切割相同识别相同，切割相同同工酶同工酶 同裂酶同裂酶eg:HpaMsp-CC GG-C*C GG-GG CC-GG CC-八八.限制酶反应的影响因素限制酶反应的影响因素1.温度：一般温度：一般37 C，有例外，有例外,如：如：SmaI25 C，BclI50 C

7、，TaqI65 C2.缓冲液：高、中、低盐之分缓冲液：高、中、低盐之分(NaCl)3.时间：时间：1-1.5小时小时4.反应体积和甘油浓度：反应体积和甘油浓度：酶酶8.0)存在有害试剂存在有害试剂(1%乙乙醇醇,DMSO,乙二醇乙二醇)阳离子变化阳离子变化:Mn+,Co+,Zn+,Cu+代替代替mg+酶的灭活酶的灭活1.加热加热2.酚抽提酚抽提 第二节第二节修饰酶修饰酶一一.分类分类细菌细菌DNA聚合酶聚合酶*E.ColiDNA聚合酶（全酶）聚合酶（全酶）*Klenow酶酶T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶*测序酶（修饰的测序酶（修饰的T7pol）*TaqDN

8、A聚合酶聚合酶*反转录酶反转录酶末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶依赖于依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶SP6噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶T3噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶T4噬菌体噬菌体RNA聚合酶聚合酶连接酶连接酶E.ColiDNA连接连接*T4DNA连接酶连接酶T4噬菌体噬菌体RNA连接酶连接酶激酶激酶T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶磷酸酶磷酸酶*碱性磷酸酶碱性磷酸酶核酸酶核酸酶Ba131核酸酶核酸酶S1核酸酶核酸酶绿豆核酸酶绿豆核酸酶RNaseARNaseT1DNaseIEXo 噬菌体外切核酸酶噬菌体外切核酸酶二二.聚合酶聚合酶1.1.E.ColiDNA聚合酶聚合酶活

9、性活性:（1）53 DNA聚合酶活性聚合酶活性（2）35 核酸外切酶活性核酸外切酶活性（3）53 核酸外切酶活性核酸外切酶活性主要用途：切口平移法标记主要用途：切口平移法标记DNA3.T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶活性：（活性：（1）53 聚合酶活性聚合酶活性（2）35 外切核酸酶活性外切核酸酶活性,比比Klenow酶酶强强200倍倍用途用途:3突出端切平突出端切平4.T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶活性活性：53 聚合酶活性聚合酶活性很强很强,无无35 外切核酸酶活性外切核酸酶活性主要用途：主要用途：修饰后用于测序修饰后用于测序5.Taq酶酶耐热耐热(75-80 C)的的DNA聚合酶专

10、用于聚合酶专用于PCR6.逆转录酶：逆转录酶：AWV(源于源于鸟成髓细胞白血病病毒鸟成髓细胞白血病病毒)，Mo-MLV(源于源于Moloney鼠白血病病毒鼠白血病病毒)活性：活性：(1)53 聚合酶活性聚合酶活性(2)RNaseH活性活性(Mo-MLV小小,cDNA得率高得率高)主要用途：主要用途：(1)反转录反转录cDNA(2)标记标记5 突出端（补平）突出端（补平）(3)测序测序四四.连接酶连接酶 T4DNA连接酶连接酶连接：连接：粘端，平端，粘端，平端，dsDNA中的切口，中的切口，杂交体连接杂交体连接五五.碱性磷酸酶碱性磷酸酶包括细菌碱性磷酸酶包括细菌碱性磷酸酶(BAP)和小肠碱性磷酸酶和小肠碱性磷酸酶(CIP),虾碱性磷酸酶虾碱性磷酸酶(SAP)用途用途:去除去除DNA、RNA、NTP、dNTP的的5 磷酸根磷酸根六六.核酸酶核酸酶1.DNA1.DNA酶酶 为为DNADNA内切核酸酶内切核酸酶,水解单链或双链水解单链或双链 用途用途:(1):(1)缺口平移标记探针时产生随机切口缺口平移标记探针时产生随机切口 (2)(2)降解降解DNADNA2.RNA2.RNA酶酶 内切核糖核酸酶内切核糖核酸酶,专用专用降解降解RNARNA