基因工程常用的工具酶.ppt

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1、第二章第二章 基因工程常用的工具酶基因工程常用的工具酶第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：简称限制酶简称限制酶。是一类能识别双链。是一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的双链结构的核酸内切酶核酸内切酶 20世纪世纪50年代发现：年代发现：噬菌体噬菌体 E.coli B PFU10-4 E.coli B PFU1噬菌体噬菌体DNA被降解被降解DNA被修饰被修饰E.coli B限制性核酸内切酶：降解外来限制性核酸内切酶：降解外来DNA 防御防御修饰酶：修饰酶：DNA甲基化甲基化

2、 保护保护寄主细胞控制的限制与修饰系统（寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！体系）！一、限制酶的种类一、限制酶的种类限制修饰活性限制修饰活性酶蛋白结构酶蛋白结构相对分子质量相对分子质量切割位点切割位点切割作用辅助因子切割作用辅助因子实用性实用性代表代表型酶型酶 型酶型酶 型酶型酶同时存在同时存在 单独存在单独存在 同时存在同时存在多亚基结构多亚基结构 单亚基结构单亚基结构 两个亚基两个亚基 30万万dal 2-10万万dal 、之间之间 与识别位点不一致与识别位点不一致 与识别位点一致与识别位点一致 与识别位点不一致与识别位点不一致 Mg2+、ATP、SAM Mg2+Mg2+、SAM

3、低低 高高 低低 EcoK、EcoB Hind EcoP二、限制酶的命名二、限制酶的命名命名原则命名原则限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小写）表示寄主物种写）表示寄主物种菌株名位于其后菌株名位于其后 罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统罗马数字表示同一寄主菌株的不同限制修饰系统 Haemophilus influenzae d Hind、Hind、Hind 属名属名 种名种名 株名株名 不同限制修饰系统不同限制修饰系统 三、三、型限制酶的特性型限制酶的特性-识别序列识别序列识别双链识别双链DNA分子中特定的分子中特定的

4、4-8对核苷酸序列对核苷酸序列5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列的识别序列EcoR I的切割位点的切割位点5 G A G G C C G A G 33 C T C C G G C T C 5Hae的识别序列的识别序列Hae 的切割位点的切割位点大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧部分限制酶能识别多种核苷酸序列部分限制酶能识别多种核苷酸序列5 G C G T Py Pu A C G A G 33 C G C A Pu Py T G C T C 5Hind的识别序

5、列的识别序列Py dCMP、dTMPPu dAMP、dGMP识别序列呈典型的旋转对称型识别序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列的识别序列EcoR I的切割位点的切割位点回文结构回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构双螺旋结构三、三、型限制酶的特性型限制酶的特性-切割后形成的末端切割后形成的末端粘性末端：粘性末端：5 GTGAATTCGA 33 CACTTAAGCT 5EcoR I5 GTG

6、AATTCGA 33 CACTTAA GCT 5平齐末端：平齐末端：5 GAGGCCGAG 33 CTCCGGCTC 55 GAGG CCGAG 33 CTCC GGCTC 5Hae彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端彼此具有互补核苷酸的单链延伸末端三、三、型限制酶的特性型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶、同裂酶同尾酶同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性 末末端的一类限制酶端的一类限制酶5 GTGGATCCGA 33 CACCTAGGCT 5BamH I 5 GTG GATCCGA 33 CACCTAG GCT 55 GTTGATCAG

7、A 33 CAACTAGTCT 5 Bcl I5 GTT GATCAGA 33 CAACTAG TCT 5BamHIBamHI、BclIBclI为一组同尾酶为一组同尾酶同裂酶同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶5 GTGATCGA 33 CACTAGCT 5Sau3A I5 GAGATCCA 33 CTCTAGGT 5MboI5 GTCCCGGGGA 33 CAGGGCCCCT 5XmaI5 GTCCCGGGGA 33 CAGGGCCCCT 5SmaI四、影响限制酶活性的因素四、影响限制酶活性的因素DNA的纯度：的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、蛋白质、苯

8、酚、氯仿、EDTA、SDS增加限制酶用量增加限制酶用量扩大酶催化反应体系扩大酶催化反应体系延长酶催化时间延长酶催化时间DNA的甲基化程度：的甲基化程度：反应温度：反应温度：DNA的分子结构：的分子结构：酶缓冲液组成：酶缓冲液组成：甘油浓度：甘油浓度：MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HCl：-巯基乙醇巯基乙醇/二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：）：牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSA）：第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶 DNA连接酶：能够催化双链连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的片段相邻的3羟基与羟基与5磷酸基形成磷酸二酯键的酶磷酸基形成磷酸二酯键的酶作用特点作用特点只能连接双螺旋

9、只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链分子，不能连接单链DNA分子；分子；DNA链上必须具有游离的链上必须具有游离的3-OH和和5-P；只能封闭只能封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成 的裂口；的裂口；需要吸能：需要吸能：ATP/NAD+连接方式连接方式缺口缺口DNA:平齐末端平齐末端DNA：粘性末端粘性末端DNA：5533OH P5533OH PPOH5533基因工程中常用的连接酶基因工程中常用的连接酶T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶（T4连接酶）连接酶）大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶热稳定性热稳定性DNA连接酶连接

10、酶第三节第三节 DNADNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶：能够催化聚合酶：能够催化DNA复制和修复复制和修复DNA分子损伤分子损伤的一类酶的一类酶v作用特点作用特点 能够把脱氧核苷酸分子连续的加到能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链分子引物链的的3-OH末端末端，催，催化核苷酸的聚合化核苷酸的聚合v作用条件作用条件脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）引物链：带有引物链：带有3-OH游离基团游离基团模板：单链或双链模板：单链或双链DNA模板模板Mg2+：一、大肠杆菌一、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 （D

11、NA pol I）v酶特性：酶特性：53聚合酶活性聚合酶活性53核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5dNTP Mg2+DNA pol I3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH5 C-G-A-G-T-OH切口平移反应切口平移反应（Nick translation）v用途：用途：制备制备32P标记的标记的DNA探针探针53核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 3核酸聚合酶活性核酸聚合酶活性5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-

12、G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 DNase IDNA pol IMg2+dNTP a-32P-dATP二、二、KlenowKlenow大片段酶大片段酶DNA聚合酶聚合酶一个片段：一个片段：53核酸外切酶活性核酸外切酶活性另一个片段：另一个片段：53聚合酶活性、聚合酶活性、3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶Klen

13、owKlenow大片段酶大片段酶KlenowKlenow大片段酶特性：大片段酶特性：53聚合酶活性聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性KlenowKlenow大片段酶大片段酶用途：用途：补平限制酶切割补平限制酶切割DNA后产生的粘性末端后产生的粘性末端5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 KlenowdATP dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 用用32PdN

14、TP对对3凹端进行末端同位素标记凹端进行末端同位素标记5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowa-32P-pppdA dTTP5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 cDNA克隆中，合成克隆中，合成cDNA第二链第二链应用应用sanger双脱氧末端中止法进行双脱氧末端中止法进行DNA测序测序三、三、TagDNATagDNA聚合酶聚合酶v来源来源嗜热水生栖热菌嗜热水生栖热菌v

15、酶特性酶特性53聚合酶活性、聚合酶活性、3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性耐高温：耐高温：7580应用：应用：PCR技术（聚合酶链式反应）技术（聚合酶链式反应）PCRPCR技术技术v基本原理：类似于细胞内基本原理：类似于细胞内DNA复制过程复制过程v基本步骤基本步骤(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的

16、链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）PCRPCRPCRPCR反应示意图反应示意图反应示意图反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)9494变性变性变性变性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）温度温度温度温度（）时间时间时间时间（mi

17、nmin）949472726060循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期v特点特点待扩增的待扩增的DNA链限定在模板上的退火位点之间链限定在模板上的退火位点之间待扩增待扩增DNA链得到迅速大量扩增链得到迅速大量扩增v反应体系组成反应体系组成v影响因素影响因素模板模板dNTPDNA聚合酶聚合酶引物引物A、BMgCl2引物的设计引物的设计退火温度退火温度MgCl2浓度浓度第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶一、末端脱氧核苷酸转移酶末端转移酶（末端

18、转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化）：在没有模板存在的条件下，能催化 dNTP随机加于随机加于DNA分子的分子的3-OH端端5 p3 HOOH 3 p 5 TDTTDTMgMg2+2+dATPdATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p3 HOp 5 同聚物尾巴同聚物尾巴 Poly（dA）作用底物：作用底物：带带3-OH末端的单链末端的单链DNA5 pOH 3 TDTTDTMgMg2+2+dATPdATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p带带3-OH单链突出末端的双链单链突出末端的双链DNA5 p3 HOOH 3 p 5 TDTTDTMgMg2+2+dATPdATP

19、5 p3HOAAAAAAAAAAAAAA OH3 p 5 带带3-OH平齐末端的双链平齐末端的双链DNA5 p3 HOOH 3 p 5 TDTTDTCoCo2+2+dATPdATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 用途：用途：外源外源DNA与载体的重组与载体的重组DNA片段片段3端标记端标记二、碱性磷酸酶二、碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（细菌碱性磷酸酶（BAP）：来自）：来自E.coli小牛肠碱性磷酸酶（小牛肠碱性磷酸酶（CIP）：来自小牛肠）：来自小牛肠v作用：作用：催化核酸分子脱去催化核酸分子脱去5-P5 pOH 3 DNA or RNA5 ppp dNTP5 pppNTPBAP/CIPBAP/CIPOH 3 5 HO5 HO dNTP5 HO NTPv用途：用途：防止载体自身环化防止载体自身环化5端标记时去磷酸化端标记时去磷酸化三、三、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）v特性：催化特性：催化-P-P从从ATPATP分子转移给分子转移给DNA/RNADNA/RNA的的55-OH-OH端端v作用：作用：55端同位素标记端同位素标记5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPT4-PNPMgMg2+2+p pppATPppATP（g g-3232P-ATPP-ATP）5 p3 HOOH 3 p 5