第六章：基因文库的构建.ppt

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1、第六章：基因文库的构建第六章：基因文库的构建 高燕会高燕会主要内容：主要内容：1、基因组文库基因组文库2、cDNA文库文库3、特殊序列文库特殊序列文库4、酵母人工染色体（酵母人工染色体（PAC）基因文库就是随机克隆的集合。基因文库就是随机克隆的集合。基因文库是通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、基因文库是通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、基因文库是通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、基因文库是通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有组织、器官或细胞类型的所有组织、器官或细胞类型的所有组织、器官或细胞类型的所有DNADNA片段而构成的克隆集合体。片段而构成

2、的克隆集合体。片段而构成的克隆集合体。片段而构成的克隆集合体。通常所说的基因文库包括基因组文库和通常所说的基因文库包括基因组文库和通常所说的基因文库包括基因组文库和通常所说的基因文库包括基因组文库和cDNAcDNA文库，文库，文库，文库，两种文库构建的基本程序相同，主两种文库构建的基本程序相同，主两种文库构建的基本程序相同，主两种文库构建的基本程序相同，主 要包括载体的制备、插要包括载体的制备、插要包括载体的制备、插要包括载体的制备、插入片段的制备、载体与插入片段的连接和重组入片段的制备、载体与插入片段的连接和重组入片段的制备、载体与插入片段的连接和重组入片段的制备、载体与插入片段的连接和重组

3、DNADNA分子导入分子导入分子导入分子导入宿主菌。宿主菌。宿主菌。宿主菌。根据核酸来源不同：根据核酸来源不同：基因文库分为基因文库分为基因组文库基因组文库是由一种生物的所有基因组是由一种生物的所有基因组DNA构建而成的。构建而成的。cDNA文库文库是利用从是利用从RNA序列反转录形成序列反转录形成的的cDNA序列构建的。序列构建的。此外此外:特殊序列文库特殊序列文库是针对某些特殊基因或是针对某些特殊基因或序列而建立的。序列而建立的。构建文库所使用的构建文库所使用的载体主要载体主要有：有：噬菌体噬菌体(噬菌斑噬菌斑)粘粒粘粒(菌落菌落)质粒质粒酵母人工染色体酵母人工染色体(构建高等真核生物基构

4、建高等真核生物基因文库设计因文库设计)根据所用载体的不同：根据所用载体的不同：质粒文库质粒文库噬菌体文库噬菌体文库粘粒文库粘粒文库YAC文库文库质粒文库：质粒文库：质粒文库：质粒文库：其构建过程相对简单，但载体装载外源其构建过程相对简单，但载体装载外源其构建过程相对简单，但载体装载外源其构建过程相对简单，但载体装载外源DNADNA的长度有限，主要用于原核细胞基因组文库和的长度有限，主要用于原核细胞基因组文库和的长度有限，主要用于原核细胞基因组文库和的长度有限，主要用于原核细胞基因组文库和克隆数不多的克隆数不多的克隆数不多的克隆数不多的cDNAcDNA文库的构建。、文库的构建。、文库的构建。、文

5、库的构建。、粘粒文库和噬菌体文库：粘粒文库和噬菌体文库：粘粒文库和噬菌体文库：粘粒文库和噬菌体文库：其装载容量较大，克隆效其装载容量较大，克隆效其装载容量较大，克隆效其装载容量较大，克隆效率较高，是目前构建基因组文库和率较高，是目前构建基因组文库和率较高，是目前构建基因组文库和率较高，是目前构建基因组文库和cDNAcDNA文库最为常文库最为常文库最为常文库最为常用的载体。用的载体。用的载体。用的载体。YACYAC载体能够容纳长达载体能够容纳长达载体能够容纳长达载体能够容纳长达1Mb1Mb的外源的外源的外源的外源DNADNA，主要用于，主要用于，主要用于，主要用于超长超长超长超长DNADNA片段

6、的克隆，片段的克隆，片段的克隆，片段的克隆，第一节：基因组文库第一节：基因组文库（Genomic LibrariesGenomic Libraries）指把某种细胞的整个基因组指把某种细胞的整个基因组指把某种细胞的整个基因组指把某种细胞的整个基因组DNADNA，按一定长短，按一定长短，按一定长短，按一定长短要求，酶解成若干片段，在与适当的载体分子要求，酶解成若干片段，在与适当的载体分子要求，酶解成若干片段，在与适当的载体分子要求，酶解成若干片段，在与适当的载体分子重组后，引入相应宿主细菌的细胞中，形成一重组后，引入相应宿主细菌的细胞中，形成一重组后，引入相应宿主细菌的细胞中，形成一重组后，引入

7、相应宿主细菌的细胞中，形成一大批含有重组体大批含有重组体大批含有重组体大批含有重组体DNADNA分子的细胞克隆群体。分子的细胞克隆群体。分子的细胞克隆群体。分子的细胞克隆群体。即：含有某种生物全部遗传信息的重组即：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分分子的子的克隆总和克隆总和建立基因组文库，取决于两项技术系统建立基因组文库，取决于两项技术系统一是具有包装能力的一是具有包装能力的一是具有包装能力的一是具有包装能力的载体系统载体系统载体系统载体系统，二是二是二是二是离体包装系统离体包装系统离体包装系统离体包装系统。（1）载体系统 具有包装能力的载体系统主要有两类：具有包装能力的载体系统主要有两类

8、：噬菌体和粘粒噬菌体和粘粒A A噬菌体载体噬菌体载体 插入型插入型插入型插入型载体，只有一个可供外源载体，只有一个可供外源载体，只有一个可供外源载体，只有一个可供外源DNADNA插入的酶切位插入的酶切位插入的酶切位插入的酶切位点。点。点。点。取代型取代型取代型取代型载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的DNADNA片段可以被外源片段可以被外源片段可以被外源片段可以被外源DNADNA取代。取代。取代。取代。取代型载体应用最广泛取代型载体应用最广泛取代型载体应用最广泛取代型载体应用最广

9、泛如如如如 EMBL1-4EMBL1-4是一类取代型载体系列是一类取代型载体系列是一类取代型载体系列是一类取代型载体系列 B B粘粒粘粒 粘粒作为载体的特点是：粘粒作为载体的特点是：粘粒作为载体的特点是：粘粒作为载体的特点是：一般质粒的特性外还能装载大片段的外源一般质粒的特性外还能装载大片段的外源一般质粒的特性外还能装载大片段的外源一般质粒的特性外还能装载大片段的外源DNADNA，有可以识别噬菌体包装的有可以识别噬菌体包装的有可以识别噬菌体包装的有可以识别噬菌体包装的“cos”cos”位点位点位点位点。包包包包装装装装时时时时，只只只只有有有有能能能能够够够够达达达达到到到到所所所所需需需需片

10、片片片段段段段的的的的分分分分子子子子量量量量标标标标准准准准的的的的重重重重组组组组子子子子才才才才能能能能被被被被装装装装入入入入噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的外外外外壳壳壳壳内内内内，形形形形成成成成有有有有感感感感染染染染能能能能力力力力的颗粒。的颗粒。的颗粒。的颗粒。然后，经过转导将外源然后，经过转导将外源然后，经过转导将外源然后，经过转导将外源DNADNA克隆化，达到建库目的。克隆化，达到建库目的。克隆化，达到建库目的。克隆化，达到建库目的。质粒噬菌体质粒噬菌体质粒噬菌体质粒噬菌体（2 2）离体包装系统）离体包装系统 A对对带带有有外外源源DNA的的杂杂合合分分子子有有直直接接筛

11、筛选选和富集的作用。和富集的作用。B提高重组提高重组DNA分子产生克隆的频率分子产生克隆的频率离体包装系统由离体包装系统由两种两种具有具有突变突变的溶源化的的溶源化的大肠杆菌大肠杆菌组成。组成。溶源化菌株是指具有形成和释放噬菌体的溶源化菌株是指具有形成和释放噬菌体的潜在能力的菌株。潜在能力的菌株。基因组文库的规模基因组文库的规模N基因组文库克隆总数基因组文库克隆总数P所需机率所需机率N=f插入片段与基因组插入片段与基因组DNA长度之比长度之比建立基因组文库的一般程序建立基因组文库的一般程序1载体载体DNA片段的制备片段的制备DNA分离纯化分离纯化限制酶切限制酶切脱磷酸化反应脱磷酸化反应2供体供

12、体DNA片段的制备片段的制备总总DNA分离纯化分离纯化机械剪切法机械剪切法分离特定大小分离特定大小DNA片段片段酶法酶法部分酶切部分酶切分离特定大小分离特定大小DNA片段片段完全酶切完全酶切ln（1-P）ln（1-f）3.供体与载体供体与载体DNA连接连接要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种浓度和两种DNA分子的克分子比率。分子的克分子比率。4.重组重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组复制，

13、重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）分子被扩增（重组子比率可能发生变化）5.基因组文库质量的评价基因组文库质量的评价1）文库规模）文库规模-随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。2）重组频率）重组频率-频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。作量。第二节第二节 、cDNA文库文库定义：定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部离到的全部mRNA经反

14、转录成经反转录成cDNA后再重后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。1.基因特异性基因特异性常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：15%mRNA，8085%rRNA，1015%tRNA2.器官特异性器官特异性不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所所组建的组建的cDNA文库也就不同文

15、库也就不同1、cDNA文库的特点文库的特点4.不均匀性不均匀性在同一个在同一个cDNA文库中，不同类型的文库中，不同类型的cDNA分分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。库的另一差别。5.各各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）是表达型的）3.代谢或发育特异性代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结处于不同代谢阶段（或发育阶段

16、）的结构基因表达亦不相同构基因表达亦不相同2 2、cDNAcDNA文库文库 (1)(1)原理：原理：RNA cDNA RNA cDNA 克隆克隆 真核基因：内含子和特定的调控结构真核基因：内含子和特定的调控结构采用构建采用构建cDNAcDNA文库是为了对某些真核基因进文库是为了对某些真核基因进行研究行研究N=f为某一特定为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部）的分子数目与全部cDNA(mRNA）分子数目之比）分子数目之比ln(1p)ln(1f)3、cDNA文库的规模文库的规模4、建立、建立cDNA文库的一般程序文库的一般程序1.载体载体DNA片段的制备片段的制备2.多聚（多聚（A）RN

17、A的分离与纯化的分离与纯化3.双链双链cDNA的合成的合成1）单链）单链cDNA的合成：反转录法的合成：反转录法2）第二条）第二条cDNA的合成：碱解或酶解的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去）法除去RNA分子分子2）同聚物加尾：可大大减少载体）同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接自身连接3）cDNA的定向插入的定向插入5.重组重组cDNA分子的转移和文库的建立分子的转移和文库的建立选用载体为质粒，可直接转化选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为；若为载体，则载体，则需进行体外包装、感染等。需进行体外包装、感染等。4.ds-cDNA与载体与载体DNA相连相连1）人工接头：要求具平

18、端）人工接头：要求具平端ds-cDNA，酶切时可能导，酶切时可能导致某些致某些cDNA链断裂链断裂cDNA的定向插入的定向插入 3 3特殊序列文库特殊序列文库 染色体分类库染色体分类库 显微切割法建库显微切割法建库 染色体分类库染色体分类库目的基因被定位与某个目的基因被定位与某个特定的染色体上特定的染色体上，那么，就可以构建一个关于那条染色体那么，就可以构建一个关于那条染色体的文库，并可进一步扩增目的基因。的文库，并可进一步扩增目的基因。常用的方法常用的方法是利用荧光激活器分离完整是利用荧光激活器分离完整的染色体。使用此种方法时，染色体最的染色体。使用此种方法时，染色体最好处于中期，此期的染色

19、体处于高度集好处于中期，此期的染色体处于高度集缩状态，易于操作缩状态，易于操作显微切割法建库显微切割法建库如果一个基因被定位于一条特定的染色体或如果一个基因被定位于一条特定的染色体或染色体上的某个区域，可以采用显微切割法染色体上的某个区域，可以采用显微切割法来获取材料。来获取材料。首先，首先，在光学显微镜下观察被染色的染色体。在光学显微镜下观察被染色的染色体。然后，然后，用显微镜处理器将整条染色体或某一用显微镜处理器将整条染色体或某一片段移开，并用移液管收集材料。片段移开，并用移液管收集材料。最后，最后，用收集到的材料进行建文库。用收集到的材料进行建文库。4 4酵母人工染色体酵母人工染色体(Y

20、AC)(YAC)构建高等真核生物基因文库构建高等真核生物基因文库YACYAC容纳的容纳的DNADNA片段可达片段可达10106 6YACYAC的组成的组成端粒端粒(TEL)序列序列着丝粒着丝粒(CEN)自主复制序列自主复制序列SUP-4(外源外源DNA插入失活的选择标记插入失活的选择标记)URA3和和TRP1端粒端粒(TEL)序列：序列：TEL序列贮存有染色体端粒序列贮存有染色体端粒形成的必需的信息。具有防止染色体末端被降形成的必需的信息。具有防止染色体末端被降解的功能。解的功能。着丝粒着丝粒(CEN)：这一部分的功能是保证染色体这一部分的功能是保证染色体向两极运动。它是细胞分裂不可缺少的部分

21、向两极运动。它是细胞分裂不可缺少的部分自主复制序列自主复制序列(ARS)：ARS序列具有复制起始序列具有复制起始功能，它是插入的功能，它是插入的DNA片段在酵母细胞中维持片段在酵母细胞中维持独立复制的保证。独立复制的保证。SUP-4SUP-4：这是外源这是外源这是外源这是外源DNADNA插入失活的选择标记，用插入失活的选择标记，用插入失活的选择标记，用插入失活的选择标记，用于在受体细胞筛选重组克隆。于在受体细胞筛选重组克隆。于在受体细胞筛选重组克隆。于在受体细胞筛选重组克隆。SUP-4SUP-4中中中中TrpfRNATrpfRNA基因的一个抑制突变，基因内分布有基因的一个抑制突变，基因内分布有

22、基因的一个抑制突变，基因内分布有基因的一个抑制突变，基因内分布有EcoEcoRIRI和和和和SmaSmaI I等酶切位点。当外源片段插入后，抑制基因等酶切位点。当外源片段插入后，抑制基因等酶切位点。当外源片段插入后，抑制基因等酶切位点。当外源片段插入后，抑制基因被破坏，受体细胞形成红色菌落。被破坏，受体细胞形成红色菌落。被破坏，受体细胞形成红色菌落。被破坏，受体细胞形成红色菌落。URA3URA3和和和和TRP1TRP1：URA3URA3和和和和TRP1TRP1分别位于外源分别位于外源分别位于外源分别位于外源DNADNA插入位点两侧的臂上。功能是纠正受体细胞的营插入位点两侧的臂上。功能是纠正受体

23、细胞的营插入位点两侧的臂上。功能是纠正受体细胞的营插入位点两侧的臂上。功能是纠正受体细胞的营养缺陷型，便于转染细胞的筛选。养缺陷型，便于转染细胞的筛选。养缺陷型，便于转染细胞的筛选。养缺陷型，便于转染细胞的筛选。（2 2）程序）程序 A A 经经大大肠肠杆杆菌菌扩扩增增后后的的载载体体DNADNA，用用BamBamH H I I切去载体的填充部分切去载体的填充部分B B 用用BamBamH H I I或或NotNot I I切切开开克克隆隆位位点点然然后后使使两两臂臂分分别别与与经经部部分分酶酶解解的的DNADNA大大片片段段两两端端连连接，形成带有外源片段的接，形成带有外源片段的YACYAC

24、C C 通通过过转转染染方方式式将将重重组组后后的的YACYAC导导入入受受体体细胞细胞D D筛筛选选：利利用用互互补补方方式式将将带带有有YACYAC的的酵酵母母细细胞营养缺陷型筛选出来。胞营养缺陷型筛选出来。1 1 1 1 什么是基因组文库？什么是基因组文库？什么是基因组文库？什么是基因组文库？2 2 2 2 什么是什么是什么是什么是cDNAcDNAcDNAcDNA文库？文库？文库？文库？3 3 3 3 用用用用于于于于构构构构建建建建基基基基因因因因文文文文库库库库的的的的载载载载体体体体有有有有几几几几种种种种？各各各各自自自自的的的的特点是什么？特点是什么？特点是什么？特点是什么？4 4 4 4 酵酵酵酵母母母母人人人人工工工工染染染染色色色色体体体体由由由由哪哪哪哪几几几几部部部部分分分分组组组组成成成成？各各各各自自自自的的的的功能如何？功能如何？功能如何？功能如何？画图说明画图说明画图说明画图说明RNaseHRNaseHRNaseHRNaseH法合成法合成法合成法合成cDNAcDNAcDNAcDNA的过程的过程的过程的过程