医学专题—实习二红细胞、网织红细胞检测.ppt

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1、实验诊断实习实验诊断实习(shx)二二红细胞、网织红细胞检测红细胞、网织红细胞检测第一页，共三十三页。目的目的(md)和要求和要求l熟悉正常红细胞和网织红细胞的形态学特点熟悉正常红细胞和网织红细胞的形态学特点l掌握掌握(zhngw)血红蛋白测定方法、参考值和临床意义血红蛋白测定方法、参考值和临床意义l掌握血细胞多参数报告单的正常值及其增减的临床意掌握血细胞多参数报告单的正常值及其增减的临床意义义第二页，共三十三页。红细胞计数红细胞计数(jsh)(redbloodcellcount)l红细胞计数是取一定微量血液，经稀释后计算出血液内红细胞计数是取一定微量血液，经稀释后计算出血液内所含红细胞数目所

2、含红细胞数目l原理原理(yunl)：用等渗稀释液将全血稀释至一定倍数，：用等渗稀释液将全血稀释至一定倍数，充入血细胞计数池，在光学显微镜下计数一定体积内充入血细胞计数池，在光学显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求出每升血液中的红细胞数量的红细胞数，经换算求出每升血液中的红细胞数量l方法：显微镜计数法方法：显微镜计数法第三页，共三十三页。器材器材(qci)及试剂：及试剂：l取血吸管，一次性定量取血吸管，一次性定量(dngling)采血管采血管(20ul)l计数板：是一块厚玻璃制成，板上刻度分为计数板：是一块厚玻璃制成，板上刻度分为9个大方格面积个大方格面积为为Imm2。中央大方格用于红细胞

3、计数，被双线等分成。中央大方格用于红细胞计数，被双线等分成25个中个中方格，每个中方格又划分为方格，每个中方格又划分为16个小方格个小方格。计数板与盖玻片组。计数板与盖玻片组成计数池，计数池深度为成计数池，计数池深度为0.1mml显微镜显微镜、盖玻片、刺血针、棉花等、盖玻片、刺血针、棉花等l小试管、刻度吸管小试管、刻度吸管、红细胞稀释液。、红细胞稀释液。l其它其它:75%酒精棉球及干棉球酒精棉球及干棉球第四页，共三十三页。操作操作(cozu):l取血：取血：l选择耳垂边缘或指端，先用75%酒精(jijng)棉球消毒局部皮肤。等待干后，用消毒后的刺血针刺入皮肤，深约 2 毫米。待血液从针孔流出，

4、用于棉花擦去第一滴血 l轻轻挤压，使血液流出形成绿豆大小的血滴。操作者用右手平拿取血吸管尖端浸入血滴中，缓缓吸血恰至“10”刻度处为止。然后用干棉花擦净吸管外沾附的血液第五页，共三十三页。l稀释及混匀稀释及混匀 l先准备一清洁小试管，精确滴入红细胞稀释液 1.99 毫升，备用 l 将取好的血液立即挤入上述试管中，并来回吸取小量稀释液数次，以便将残余在吸管中的血液全部(qunb)洗净 l摇动试管，充分混匀。此时血液被稀释 200 倍第六页，共三十三页。l充池充池l先将计数板及盖玻片擦干净，并将盖玻片复盖于计数池上面。l用吸管吸取己充分混匀的稀释血液一滴，滴于盖玻片的下方边缘处，稀释血液即充填入计

5、数池中。注意勿发生(fshng)气泡或使稀释血液流入计数池旁小槽内 l静置 2 3 分钟，待红细胞完全下沉稳定后进行计数第七页，共三十三页。l计数l平放计数板于显微镜台上，先用低倍镜找到计数池的中央大方格。平放计数板于显微镜台上，先用低倍镜找到计数池的中央大方格。观察红细胞是否均匀，并调整至视野中间观察红细胞是否均匀，并调整至视野中间(zhngjin)。l再转换高倍镜计数。镜下红细胞为圆形或盘形、略带黄色的细胞。如将上再转换高倍镜计数。镜下红细胞为圆形或盘形、略带黄色的细胞。如将上侧线和左侧线上的红细胞都计数在内，则不要再将下侧和右侧线上的细胞侧线和左侧线上的红细胞都计数在内，则不要再将下侧和

6、右侧线上的细胞计入计入。计数时必须按一定方向和顺序，以免将红细胞重复计数或漏数。计数时必须按一定方向和顺序，以免将红细胞重复计数或漏数。l计数计数5个中方格个中方格(即四角的及中央的中方格即四角的及中央的中方格)由红细胞总共的个数，由红细胞总共的个数，将其结果乘以将其结果乘以10。即得每立方毫米血液中所含红细胞数目，再乘以。即得每立方毫米血液中所含红细胞数目，再乘以10。即得每升血液中所含红细胞数目。即得每升血液中所含红细胞数目。第八页，共三十三页。l每升血液中红细胞数目每升血液中红细胞数目=五个中方格内红细胞个数五个中方格内红细胞个数5(变为变为0.1u1)10(变为变为1u1)106(变为

7、变为1L)200(稀释倍数稀释倍数)=五个中方格内红细胞个数五个中方格内红细胞个数1010l清洁仪器：清洁仪器：l计数后，将盖玻片及计数板用水冲洗干净，再用绸或细布擦干计数后，将盖玻片及计数板用水冲洗干净，再用绸或细布擦干l吸管先用蒸馏水，继用吸管先用蒸馏水，继用95%酒精酒精(jijng)，后用乙醚洗涤干，后用乙醚洗涤干净，保存备用净，保存备用第九页，共三十三页。注意事项注意事项l不能在有水肿、炎症、淤血等部位或刺血过浅处采血不能在有水肿、炎症、淤血等部位或刺血过浅处采血l所用吸管、试管、滴管及血细胞计数板须干净无水所用吸管、试管、滴管及血细胞计数板须干净无水l操作迅速，充池一次完成，不能有

8、气泡操作迅速，充池一次完成，不能有气泡l红细胞分布不均，每个中方格红细胞分布不均，每个中方格(fn)之间相差大于之间相差大于20个时要个时要重新充池计数重新充池计数第十页，共三十三页。血红蛋白血红蛋白(xuhngdnbi)测定测定l方法：氰化高铁血红蛋白(xuhng dnbi)测定法l原理：l血红蛋白(Hb)被高铁氰化钾K3Fe(CN)6氧化为高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子结合成氰化高铁血红蛋白（HiCN）l HiCN在540nm有一吸收峰l测定其光密度而得血红蛋白浓度浓度第十一页，共三十三页。试剂(shj)与器材器材：l分光光度计l试管(shgun)，试管(shgun)架l取血吸管:一次

9、性定量采血管(20ul)l刺血针 l蒸馏水l75%酒精及干棉球试剂：试剂：l氰化高铁血红蛋白稀释剂高铁氰化钾(ti qn hu ji)K3Fe(CN)6200mg氰化钾（KCN）50mg无水磷酸二氢钾140mgTriton X-100 1.0ml用蒸馏水溶解并稀释 至1L第十二页，共三十三页。l该试剂应呈透明、淡黄色，该试剂应呈透明、淡黄色，pHpH在在7.07.07.47.4之间，以蒸馏水作空之间，以蒸馏水作空白，在白，在540nm540nm比色，读数是比色，读数是0 0l溶液应放置棕色试剂瓶中，塞紧后保存于冰箱中（但不宜冻结），至溶液应放置棕色试剂瓶中，塞紧后保存于冰箱中（但不宜冻结），至

10、少可稳定数月少可稳定数月l如发现试剂变绿、浑浊则不能使用如发现试剂变绿、浑浊则不能使用(shyng)(shyng)l其中非离子表面活性剂可加速溶血，缩短转化时间，防止血浆蛋白改其中非离子表面活性剂可加速溶血，缩短转化时间，防止血浆蛋白改变引起的浑浊变引起的浑浊第十三页，共三十三页。实验(shyn)步骤 l在试管中准确加入HiCN稀释试剂5.0ml，作为测定管 l用血红蛋白吸管准确吸取全血20u1，擦去管端血迹，置于试剂中，冲洗3次，混匀 l将混合液放置(fngzh)3分钟以后，倒入光径1cm比色皿，用分光光度计在540nm进行比色l以蒸馏水或HiCN稀释试剂作空白管，校正光密度到0点，读取测定

11、管光密度读数 第十四页，共三十三页。l计算：计算：血红蛋白（血红蛋白（g/Lg/L）=测定管光密度测定管光密度（64458/4400064458/44000）251 251 =测定管光密度测定管光密度A 367.7 367.7 l式中：式中：（1 1）64458 64458 是目前国际是目前国际(guj)(guj)公认的血红蛋白分子量公认的血红蛋白分子量 （2 2）44000 44000 是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光度尔吸光度 （3 3）251251是稀释倍数是稀释倍数 第十五页，共三十三页。方法方法(fngf)(fngf)评估评估 l

12、HiCNHiCN法操作简便，试剂单一，显色快且稳定，可以根据吸光法操作简便，试剂单一，显色快且稳定，可以根据吸光度直接度直接(zhji)(zhji)计算结果被列为国际血红蛋白测定的参考计算结果被列为国际血红蛋白测定的参考方法，也是我国推荐的首选方法方法，也是我国推荐的首选方法l高球蛋白血症和白细胞明显增高可导致反应液浑浊而影响结果高球蛋白血症和白细胞明显增高可导致反应液浑浊而影响结果 第十六页，共三十三页。注意事项注意事项 l用吸血管吸血过程应仔细、认真，准确把握住吸入的血液量是初学者的一个难点，也是实验结果准确与否的一个关键lHiCN稀释液不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN含量下降(xijin

13、g)，测定结果偏低应贮存在棕色有塞玻璃瓶中l4冰箱保存一般可用数月，但不能在0以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使溶液褪色失效第十七页，共三十三页。注意事项注意事项 分光分光(fnun)光度计使用要点光度计使用要点1、开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置使用波长。仪器预热20分钟。2、打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”。盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”。3调整仪器的“00.0”和“100%”，将选择开置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然

14、后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度的值。第十八页，共三十三页。注意事项注意事项 l氰化钾是剧毒品，配制稀释液时要按剧毒品管理程序保管、操作l配制好的HiCN稀释液中因氰化钾含量低，又有高铁氰化钾存在，毒性不是很大。若进入体内，高铁氰化钾氧化血红蛋白，生成高铁血红蛋白。后者结合CN，起到一定的解毒(ji d)作用，但仍应妥善保管l测定后的废液不能与酸性溶液混合氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体l为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中应注意废液处理，可用除毒液除毒第十九页，共三十三页。l除毒方法l取硫酸亚铁（FeSO47H2O）二份加NaOH一份，在研钵中研细，配成100

15、g/L的悬液。每1000ml废液加上述除毒液5ml，放置3小时，不时(bsh)搅拌，使剧毒的氰化钾成为无毒的亚铁氰化钾l废液加入等量的水，混合后每升加次氯酸铋液(安替福化)35 毫升，充分混匀后敞开容器，置室温 15 小时后，排入下水道第二十页，共三十三页。参考值参考值多次检查多次检查(jinch)(jinch)红细胞数血红蛋白成年男性（4.05.5）1012/L (400550万/mm3)120160g/L(1216g/dl)成年女性（3.55.0）1012/L (350500万/mm3)110150g/L (1115g/dl)新生儿（6.07.0）1012/L (600700万/mm3)1

16、70200g/L (1720g/dl)第二十一页，共三十三页。临床意义临床意义l红细胞及血红蛋白增多单位容积血液中红细胞及血红蛋白增多单位容积血液中RBC及血红蛋白量及血红蛋白量高于参考高限高于参考高限可分为相对性增多和绝对性增多两大类可分为相对性增多和绝对性增多两大类l红细胞及血红蛋白减少单位容积循环血液中红细胞及血红蛋白减少单位容积循环血液中RBC、血红蛋白、血红蛋白量及红细胞比积低于参考值低限，称为量及红细胞比积低于参考值低限，称为(chnwi)贫血。贫血。l贫血可概括为两大类：即生理性减少和病理性减少贫血可概括为两大类：即生理性减少和病理性减少l各种贫血红细胞与血红蛋白的减低不一定呈平

17、行关系各种贫血红细胞与血红蛋白的减低不一定呈平行关系第二十二页，共三十三页。RBC与与Hb小结小结(xioji)RBCRBCHbHb增多增多(zn du)(zn du)减少减少(jinsho)(jinsho)相对增多相对增多绝对增多绝对增多原发增多原发增多继发增多继发增多EpoEpo代偿性增多代偿性增多EpoEpo非代偿性增多非代偿性增多缺氧缺氧肿瘤肿瘤真性红细胞增多症真性红细胞增多症脱水脱水生理性减少生理性减少病理性减少病理性减少儿童，孕妇，老人儿童，孕妇，老人生成减少生成减少破坏增加破坏增加丢失过多丢失过多各种溶血各种溶血各种失血各种失血造血干造血干CC障碍障碍DNADNA合成障碍合成障碍

18、再障再障巨贫巨贫HbHb合成障碍合成障碍多种机制多种机制缺铁贫缺铁贫白血病白血病造血原料缺乏造血原料缺乏第二十三页，共三十三页。RBC与与Hb小结小结(xioji)红细胞（1012/L）血红蛋白（g/L）增多正常减少增多正常减少男性6.04.0-5.54.0170g120-160g120g女性5.53.5-5.03.5160g110-150g110g类型MCVMCHMCHC临床意义大细胞性贫血100343236巨幼细胞贫血正细胞性贫血80100 27343236再障、骨髓病性急性失血性贫血小细胞性贫血8027 32缺铁性贫血铁粒幼细胞性贫血海洋性贫血单纯小细胞贫血80273236慢性感染，肝病

19、，尿毒症，恶性肿瘤，风湿病第二十四页，共三十三页。网织红细胞计数网织红细胞计数(jsh)l原理原理l网织红细胞是晚幼红细胞脱核后但尚未完全成熟的红细胞网织红细胞是晚幼红细胞脱核后但尚未完全成熟的红细胞l胞质中尚有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质残存胞质中尚有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质残存,经经煌焦油蓝煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色或新亚甲蓝活体染色(rns)(rns)后后,胞质中可见蓝或蓝绿色枝点胞质中可见蓝或蓝绿色枝点状甚至网织状结构状甚至网织状结构第二十五页，共三十三页。l取材：人的外周血液（涂片）取材：人的外周血液（涂片）l方法：方法：煌焦油煌焦油(jioyu)(jioyu)蓝蓝活体染色法近年

20、来还可通过某些血活体染色法近年来还可通过某些血液自动分析仪及流式细胞术检测法进行网织红细胞计数液自动分析仪及流式细胞术检测法进行网织红细胞计数l操作：取一滴血与煌焦油蓝染液混合操作：取一滴血与煌焦油蓝染液混合，制成涂片，制成涂片l在油镜下，观察红细胞胞质内蓝色的丝网状结构在油镜下，观察红细胞胞质内蓝色的丝网状结构计数计数10001000个红细胞个红细胞，求得其中网织红细胞百分数，求得其中网织红细胞百分数第二十六页，共三十三页。染色染色(rns)及涂片要点及涂片要点l在洁净在洁净(jijng)载玻片上加载玻片上加1煌焦油兰酒精液一滴；煌焦油兰酒精液一滴；待干待干l取新鲜血液一滴，取新鲜血液一滴，

21、滴于载玻片的染液上滴于载玻片的染液上，轻轻搅拌，轻轻搅拌l保持载玻片上血液不致干涸，染色保持载玻片上血液不致干涸，染色5分钟或更长分钟或更长l常规涂片方法，推成薄而均匀的血膜片，常规涂片方法，推成薄而均匀的血膜片，自然干燥自然干燥第二十七页，共三十三页。l89.5 m，Wright染色(rns)呈嗜多色性红细胞第二十八页，共三十三页。RC小结小结(xioji)RCRC参考值参考值绝对值绝对值百分数百分数0.50.5-1.5-1.5，平均，平均(pngjn)(pngjn)1 12424841084109 9/L/L临床意义临床意义观察观察(gunch)(gunch)病情病情鉴别诊断鉴别诊断诊断诊

22、断减少减少增多增多观察病情观察病情鉴别诊断鉴别诊断诊断诊断造血不良造血不良造血良好造血良好营养性贫血营养性贫血溶血性贫血溶血性贫血失血性贫血失血性贫血再障性贫血再障性贫血试治有效试治有效高变低示好转，反之亦然高变低示好转，反之亦然试治无效试治无效由低逐渐增高示好转由低逐渐增高示好转第二十九页，共三十三页。第三十页，共三十三页。第三十一页，共三十三页。第三十二页，共三十三页。内容(nirng)总结实验诊断实习二红细胞、网织红细胞检测。小试管、刻度吸管、红细胞稀释液。平放计数板于显微镜台上，先用低倍镜找到计数池的中央(zhngyng)大方格。计数时必须按一定方向和顺序，以免将红细胞重复计数或漏数。不能在有水肿、炎症、淤血等部位或刺血过浅处采血。所用吸管、试管、滴管及血细胞计数板须干净无水。氰化钾（KCN）50mg。氰化钾是剧毒品，配制稀释液时要按剧毒品管理程序保管、操作。0.5-1.5，平均1。The End第三十三页，共三十三页。