(3.8.1)--2.8色谱技术的原理-色谱及色谱-质谱技术在复杂基质中赤霉素痕量.pdf
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1、专题论述 食品科学 2020,Vol.41,No.13 249色谱及色谱-质谱技术在复杂基质中赤霉素痕量分析中的应用姜长岭1,2,代金霞1,2,刘 新1,3,鲁成银1,3,陈红平1,3,*(1.中国农业科学院茶叶研究所,浙江 杭州 310008;2.中国农业科学院研究生院,北京 100081;3.农业农村部茶叶产品质量安全风险评估实验室,浙江 杭州 310008)摘 要:赤霉素(gibberellins,GAs)是一类在植物体内广泛存在的植物激素,在植物生长、发育以及对环境胁迫的反应中起着至关重要的作用。GAs是一类四环二萜酸,其基本结构是二十碳赤霉烷。到目前为止,已发现的GAs多达136 种
2、。随着近年来GAs在农业生产中的广泛使用以及相关毒性的深入研究,由GAs引起的食品安全问题得到越来越多的关注。GAs精准分析技术有助于深入解析GAs代谢行为及其生理活性与毒性。由于GAs的不稳定性及其极低的含量(一般为ng/g,甚至为pg/g水平),复杂基质中GAs分析的前处理技术和分析手段经历了不断更新与提升的过程。本文综述了过去10 年GAs痕量分析中前处理技术和分析手段上的发展与突破,并展望了复杂基质中GAs分析技术发展趋势。关键词:赤霉素;色谱-质谱;痕量分析;前处理技术;分析手段Chromatography Alone and Coupled with Mass Spectromet
3、ry for the Determination of Trace Gibberellins in Complex Matrices:A ReviewJIANG Changling1,2,DAI Jinxia1,2,LIU Xin1,3,LU Chengyin1,3,CHEN Hongping1,3,*(1.Tea Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310008,China;2.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Scienc
4、es,Beijing 100081,China;3.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Tea Products,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Hangzhou 310008,China)Abstract:Gibberellins(GAs)are a class of plant hormones that are widely found in plants,which play a crucial role in plant growth,development,an
5、d response to environmental stress.GAs are a class of tetracyclic diterpenic acids whose basic structure is 20-carbon gibberellin.So far,136 GAs have been found.As GAs have been extensively applied in agricultural products and intensive research efforts have been made on their toxicity in recent yea
6、rs,their potential to cause food safety issues has become a subject of growing concern.Accurate analysis of GAs are helpful for better understanding their metabolism,physiological activity and toxicity.Due to their instability and extremely low content(generally ng/g,even pg/g levels),the pretreatme
7、nt techniques and analytical methods for the detection of GAs in complex matrices are being continuously updating.This article reviews the development and breakthroughs of pretreatment techniques and analytical methods for trace analysis of GAs over the past 10 years,and future development trends ar
8、e discussed.Keywords:gibberellins;chromatography-mass spectrometry;trace analysis;pretreatment techniques;analytical methodsDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190528-348中图分类号:O656 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2020)13-0249-11引文格式:姜长岭,代金霞,刘新,等.色谱及色谱-质谱技术在复杂基质中赤霉素痕量分析中的应用J.食品科学,2020,41(13):249-259.DOI:10.7506/spkx1
9、002-6630-20190528-348.http:/收稿日期:2019-05-28基金项目:国家自然科学基金面上项目(31671941);中国农业科学院创新团队茶叶质量与风险评估团队项目(CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS-06);现代农业产业技术体系建设专项(nycytx-19)第一作者简介:姜长岭(1995)(ORCID:0000-0003-0298-3939),男,硕士研究生,研究方向为茶叶加工与质量安全。E-mail:*通信作者简介:陈红平(1977)(ORCID:0000-0002-8631-5999),男,副研究员,研究方向为茶叶质量安全与风险评估。E-mail:万
10、方数据250 2020,Vol.41,No.13 食品科学 专题论述JIANG Changling,DAI Jinxia,LIU Xin,et al.Chromatography alone and coupled with mass spectrometry for the determination of trace gibberellins in complex matrices:a reviewJ.Food Science,2020,41(13):249-259.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20
11、190528-348.http:/赤霉素(gibberellins,GAs)是一种植物生长激素,能够刺激细胞伸长并影响各种发育过程,如刺激茎伸长、种子萌发、休眠、开花、性别表达、酶诱导以及叶和果实衰老等。1926年,Kurosawa1研究一种导致水稻过度生长的常见疾病,发现患病水稻的过度生长是由感染植物的真菌分泌的化学物质所致。Yabuta2从培养真菌的滤液中分离出这种化学物质,称其为GAs。GAs是一类四环二萜酸,它的基本结构是二十碳赤霉烷,根据赤霉烷上双键和羟基的数目、位置不同,以及内酯环的有无,形成了不同的GAs。根据分子中碳原子数目的不同,GAs可分为两种类型:C-19 GA和C-20
12、 GA,其对应结构如 图13所示。C-19 GA是由C-20 GA转变而来,但是包含的种类多于C-20 GA。虽然在植物中发现了许多种GAs,但只有很少一部分GAs具有激素的生理活性。通常,C-19 GA是具有生物活性的GAs,其中最常见的具有生理活性的GAs有GA1、GA3、GA4和GA74。GAs按照其发现的顺序依次从GA1到GAn进行命名,GA3是第一个在结构上确认的GAs。截止到目前,在植物、真菌及细菌中已经确认有136 种GAs5。223319191010209911111212131314141515161617178877OOO446618181155COHOABOHOHOHHH
13、HH图 1 C-19 GA(A)和C-20 GA(B)的结构3Fig.1 Structures of C-19(A)and C-20(B)gibberellins3 GAs是一种广谱性的植物生长调节剂,被广泛应用于植物生长和发育的各个阶段。同时,GAs也属于低毒农药,但若短期大量摄入或长期在体内蓄积,会对机体各系统产生严重的损伤,例如许春爽等6研究发现GAs会对精子造成损伤。Erin等7研究发现,GAs与肿瘤形成也有一定关系。因此,植物源性食品中GAs的有效检测、鉴定与监测对于食品安全以及风险评估具有重要的意义。GAs痕量分析一直是GAs合成途径、生理活性和代谢调控研究的难点,随着分析仪器和分
14、析手段的不断完善,分析方法灵敏度与精密度不断提升。GAs分析包括样品前处理与仪器分析两个重要环节。样品前处理是整个分析周期中的关键过程,可以分离甚至富集分析物,实现超痕量分析,消除基质干扰的影响。因此,选择一种快速、简单和自动化的样品前处理方法,可以帮助节省时间和精力,降低偶然误差和系统误差,减少溶剂用量。GAs检测的前处理技术经历了传统的液液萃取(liquid liquid extraction,LLE)向固相萃取(solid phase extraction,SPE)、液相微萃取(liquid phase microextraction,LPME)以及一些新兴的样品前处理技术的发展过程8。
15、此外,在过去20 年中已经开发出固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)和LPME样品制备的小型化装置,这种装置具有进一步减少溶剂消耗的优点,特别适用于痕量分析和原位分析。这些创新性的样品制备方法是GAs分析的有力工具,有希望用于植物内源性GAs追踪和调节机制的研究。近年来,随着仪器分析技术的高速发展,尤其是串联质谱、高分辨质谱(high resolution mass spectrometry,HRMS)分析仪器在提高灵敏度、精密度以及分辨率方面取得突飞猛进的进步,使得GAs分析技术迈上一个新平台,实现了快速、高通量、高灵敏的精准定量分析,解决了植物激素
16、含量低、结构相近以及复杂基质干扰等导致的传统色谱法无法精准定量的缺陷,同时实现了植物组织微量样品分析,以及微区域GAs分布特征分析等。本文查阅了近10 年来关于GAs检测分析的报道,从样品前处理与仪器分析两个方面分别介绍各种技术方法以及应用的具体实例。此外,作为可行性更高且可以提高检测灵敏度的补充方法,还将突出总结富集效果更好的改良SPE技术与化学标记法这两类前处理方法,以及基于液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、新型纳升电喷雾离子源(nano-electron spray ionization,Nano-ESI)技术
17、与HRMS的应用。1 GAs前处理方法研究进展在最近10 年里,GAs检测的样品前处理技术已经有了广泛且深入的研究。对Web of Science数据库中的文献进行检索,总结了20122018年以来关于GAs检测方法的文章,结果如图2所示。平均每年发表10 篇关于GAs检测方法的文章;前处理过程主要采用SPE与LLE,部分文献开发了新型的前处理技术,或是在SPE与LLE的基础上进一步优化,对于一些新型复杂的标记技术以及一些快速检测的传感器技术都归于其他方法中;在分析手段方面,LC法依旧是近年来针对GAs检测的主流方法,按照LC所连接检测器的不同,其分为LC-紫外光谱法、LC-荧光检测法等,其中
18、LC-MS是目前最常用的GAs分析方法。万方数据专题论述 食品科学 2020,Vol.41,No.13 25102012 2013 2014 2015A2016 2017 201815105论文数量年份0SPELLEMSPDMITBQuEChERS LLME其他40302010论文数量样品前处理方法0LCLC-MS GC-MSCE其他C5040302010论文数量分方法A.每年发表关于GAs检测的论文数量;B.GAs检测中不同前处理技术的文章数量(MSPD.基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion);MIT.分子印迹技术(molecular imprinti
19、ng technique);QuEChERS.快速、简便、廉价、有效、粗略和安全(quick,easy,cheap,effective,rugged,and safe);LLME.液液微萃取(liquid liquid microextraction);C.GAs检测中不同分析手段的论文数量(GC-MS.气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry);CE.毛细管电泳)。图 2 基于Web of Science数据库检索的20122018年发表的关于 GAs检测的论文Fig.2 Summary of published papers on gibbe
20、rellin determination from 2012 to 2018 retrieved from the Web of Science database1.1 固相萃取法SPE是运用最为广泛的样品纯化除杂方法,它主要通过在SPE柱中填充吸附剂从而达到对目标化合物的净化效果。根据弱酸类植物激素的极性进行纯化,常用的SPE柱按照其填充的吸附剂的不同有如下几类:十八烷基硅烷键合硅胶反相吸附剂(如C18柱)、亲水亲脂复合物两性吸附剂(如HLB柱)、混合模式阴离子交换吸附剂(如MAX柱)、混合模式阳离子交换吸附剂(如MCX柱)。SPE技术因萃取柱以及提取试剂的不同,其萃取效果有显著差异。如C1
21、8柱可以除去大量非极性的叶绿素基质,同时也可以通过调节淋洗液和洗脱液来除去一些极性很强的基质。但C18除杂能力有限,当植物中含有大量非极性基质时常常会产生很大的基质干扰峰。所以单纯采用C18柱仅适用于一些基质不太复杂的样品。Cui Kuanyan等9利用LC-ESI-MS/MS检测油菜中GA1、GA3、GA4 3 种GAs的回收率,比较MCX、MAX、C18与HLB这4 种SPE柱的净化效果,结果显示单独使用情况下,MCX柱相对优于MAX柱、C18柱与HLB柱(GA3除外,在使用MCX柱时其对应回收率低至19.5%),而其他SPE柱对3 种GAs的回收率均小于50%。所以一般来讲,单纯采用SP
22、E柱的净化方法难以处理复杂的植物组织提取液,因此串联SPE柱应用更为广泛。Urbanov等10以拟南芥为材料,前处理过程以80%(体积分数,下同)乙腈4%甲酸作为提取液,运用两次SPE步骤(MCX柱串联HLB柱和单一MAX柱)对GAs进行净化处理,随后进行超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)-ESI-MS/MS测定,得到一种可行性较高的对多种GAs进行同时定量的方法。最终得到20 种GAs的内标平均回收率为72%,检出限(limit of detection,LODs)小于0.1 pmol/mg。Liu Shichang等1
23、1也是采用类似的两次SPE步骤(MCX柱和MAX柱),结合HPLC-ESI-MSn检测,成功地对10 种GAs进行定量分析。最终得到10 种GAs的LODs都小于400 fmol/mL(其中8 种GAs小于100 fmol/mL)。提取洗脱离心淋洗废液BTA衍生化OOONNNC18OCHORRN废液乙醚水过SPE柱(甲醇-水)图 3 串联SPE结合LLE的前处理流程12Fig.3 Scheme of sample preparation by tandem solid phase extraction followed by liquid liquid extraction12除了单独运用SP
24、E技术,SPE结合其他技术原理(如LLE)也常用于GAs检测。Chen Mingluan等12利用SPE结合LLE对小麦叶中酸性植物激素进行富集,结合纳升 LC-电喷雾离子源-飞行时间质谱(nano-LC-ESI-quadrupole-time of flight-MS,Nano-LC-ESI-Q-TOF-MS)检测,得到一种能够有效检测10 种GAs的前处理方法。其前处理过程如图3所示,小麦提取液经C18柱与SAX万方数据252 2020,Vol.41,No.13 食品科学 专题论述柱净化后,再经LLE萃取,最后通过衍生化试剂3-溴乙酰基三甲基溴化铵(3-bromoactonyltrimet
25、hylammonium bromide,BTA)进行柱前衍生化反应,最终得到10 种GAs的LODs均小于60 pg/mL,回收率在85%105%之间。Cui Kuanyan等9用同样的前处理方式,以SPE与LLE相结合的前处理方式,LC-EI-MS检测,成功建立了一种同时测定GA1、GA3、GA4 3 种GAs的方法,方法回收率为80%115%,LOD分别为0.012、0.004 2、0.016 ng/mL。虽然单独使用SPE柱对GAs的净化效果并不理想,但是基于SPE的原理,进行不同SPE柱组合或者SPE结合LLE却能够起到很好的净化效果。这种改良SPE虽然增加了前处理过程复杂性,但却有很
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