(2.1.1)--1.1核酸与蛋白生物检测的原理-2019新型冠状病毒的核酸检测.pdf

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1、第4 1 卷第4 期2 0 2 0 年4 月计量学报A C T AM E T R O L O G I C AS I N I C AV 0 1 4 1，N o4A p r i l，2 0 2 0d o i：10 3 9 6 9 j i s s n 10 0 0-”5 8 2 0 2 0 0 4 0 12 0 1 9 新型冠状病毒的核酸检测张永卓，王晶，傅博强，黄翔，董莲华，牛春艳，杨佳怡(中国计量科学研究院，北京1 0 0 0 2 9)摘要：2 0 1 9 冠状病毒病(C O V I D 一1 9)疫情已成为国际关注的突发公共卫生事件。为应对突发病毒疫情事件，加快病毒检测并提高检测准确性变得非常

2、重要。中华人民共和国国家卫生健康委员会新型冠状病毒肺炎诊疗方案规定了核酸检测和基因测序作为确诊病例的方法，检测结果是对潜伏期人群、疑似病例人群和隔离期人群的新型冠状病毒(2 0 1 9-n C o V S A R S C o V-2)进行确诊的重要依据。对实时荧光R T P C R 检测、数字P C R 检测及基因测序方法进行了综述，并对后续监控和生物安全测量(生物计量)标准体系的建立进行了展望。关键词：计量学；新型冠状病毒；核酸检测；实时荧光逆转录-聚合酶链反应；数字聚合酶链反应；基因测序中图分类号：T B 9 9文献标识码：A文章编号：1 0 0 0 1 1 5 8(2 0 2 0)0 4

3、-0 3 9 3-0 6N u c l e i cA c i dD e t e c t i o n0 ft h eS A R S C O V-2Z H A N GY o n g z h u o，W A N GJ i n g，F UB o q i a n g，H U A N GX i a n g，D O N GL i a n-h u a，N I UC h u n-y a n，Y A N GJ i a y i(N a t i o n a lI n s t i t u t eo fM e t r o l o g y，B e i j i n g1 0 0 0 2 9，C h i n a)A b s t

4、 r a c t：T h eo n g o i n gg l o b a lC o r o n aV i r u sD i s e a s e(C O V I D-19)o u t b r e a ki sap u b l i ch e a l t he m e r g e n c yo fi n t e r n a t i o n a lc o n c e r n I ti sv e r yi m p o r t a n tt os p e e du pt h ed i a g n o s i sa n dc o n f i r m a t i o nd e t e c t i o no f

5、s u s p e c t e dc a s e sa n dq u i c k l yd i s t i n g u i s ht h ed i s e a s eo fC O V I D-19f r o mo t h e rd i s e a s e s T h en o v e lc o r o n a v i r u sp n e u m o n i ad i a g n o s i sa n dt r e a t m e n tp l a ni s s u e db yN a t i o n a lH e a l t hC o m m i t t e eo ft h eP e o p

6、 l e SR e p u b l i co fC h i n ah a ss t i p u l a t e dt h en u c l e i ca c i dd e t e c t i o no ft h e2 019 N o v e lC o r o n a v i r u s(2 019-n C o V S A R S-C O Y-2)T h ed e t e c t i o nm e t h o d so fn u c l e i ca c i dP C Ra n ds e q u e n c i n g，i n c l u d i n gr e a lt i m eq u a n

7、 t i t a t i v eP o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n(P C R)，d i g i t a lP C Rd e t e c t i o na n dg e n es e q u e n c i n gm e t h o dw e r ed e s c r i b e d Al o n gt i m em o n i t o r i n ga n db i o m e t r o l o g ys t a n d a r ds y s t e mr e l a t e dt ob i o s a f e t yw e r ep r

8、 o s p e c t e d K e yw o r d s：m e t r o l o g y；2 0 1 9-n C o V S A R S C o V-2；n u c l e i ca c i dd e t e c t i o n；R T-P C R；d P C R；g e n es e q u e n c i n g引言病毒无时无刻不在与人类共存。曾经获得过1 9 5 8 年诺贝尔医学奖的乔舒亚莱德伯格说过：“同人类争夺地球统治权的唯一竞争者，就是病毒”。病毒存在人畜共患病传播，2 0 1 9 年1 2 月突如其来的一场病毒疫情，引发对全球健康的关注，再次让我们体会重视生命，挽救生命

9、的意义。经研究分析确定此为一种新型病毒(2 0 1 9 一n C o V)引起的肺炎疾病旧3 1，通过测序准确地测定了病毒的基因序列，上传到核苷酸序列数据库(G e n B a n k)，并指出了它和非典(S A R S)病毒的相似度HJ，具有人传人家庭聚集性病例报告6J。经过综合评估，2 0 2 0 年2 月1 1 日，世界卫生组织(W H O)对新型冠状病毒感染引起的疾病正式命名“C O V I D 1 9”(C o r o n aV i r u sD i s e a s e2 0 1 9)，其中C O 代表C o r o n a(冠状)，V I 代表V i r u s(病毒)，D 代表D

10、 i s e a s e(疾病)，中文翻译为“2 0 1 9 冠状病毒病”；国际病毒分类委员会(I n t e r n a t i o n a lC o m m i t t e eo nT a x o n o m yo fV i r u s e s，I C T V)将新型冠状病毒命名为S A R S-C o V-2(S e v e r eA c u t eR e s p i r a t o r yS y n d r o m eC o r o n a v i r n s2)o收稿日期：2 0 2 0-0 2-2 9；修回日期：2 0 2 0-0 4-0 2基金项目：国家重点研发计划项目(项目编号

11、：2 0 1 8 Y F C l 2 0 0 5 0 0，课题编号：2 0 1 8 Y F C l 2 0 0 5 0 1)万方数据计量学报2 0 2 0 年4 月2 0 1 9 一n C o V S A R S C o V 一2 是一种新出现的冠状病毒，与传播于马蹄蝠的蝙蝠冠状病毒B t C o V 部分R d R p 基因的核苷酸同源性为9 8 7 J。它是个单链核糖核酸(r i b o n u c l e i ca c i d，R N A)病毒，相对于人类的D N A 遗传物质，容易发生变异重组。科学家正在探索病毒传播时可能利用的中间宿主。图1 为国家病原微生物资源库(中国疾病预防控制中

12、心病毒病预防控制所)发布的新型冠状病毒照片。(a)武汉株0 1(b)武汉株0 2图1 新型冠状病毒F i g 12 0 1 9 一N o v e lC o r o n a v i r u s2 0 2 0 年1 月3 0 日，W H O 宣布本次疫情为“国际关注的突发公共卫生事件(P u b l i cH e a l t hE m e r g e n c yo fI n t e r n a t i o n a lC o n c e r n)”。在应对突发公共卫生事件时，需加强疫情信息监测、加快疑似病例的诊断等防控措施，迅速区分流行C O V I D 1 9疫症和一般病症如流感，避免交叉感染疫情

13、扩散，及时提供针对性救助和有效利用医疗资源。截止2 0 2 0 年3 月1 5 日，全球的新冠肺炎确诊病例已超过1 5 万人感染。因此，适用于临床诊断的快速、准确检测方法非常重要。临床对于C O V I D-1 9 的诊断需要分层诊断并尽量实现全面互补，诊断技术包括病毒标本核酸检测、基因测序、鉴别诊断、影像学特征诊断等1 9 1 I。随着对技术认识的进步，中华人民共和国国家卫生健康委员会新型冠状病毒肺炎诊疗方案在不断进行完善，到目前已7 次修订。为尽快实现临床特点的实验室检查、确诊诊断标准，在新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)中规定“疑似病例具备以下病原学证据之一者可为确诊病例：一是实时荧

14、光R T P C R 检测新型冠状病毒核酸阳性；二是病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源”。引因此，病毒核酸P C R 检测和基因测序方法在此次疫情确诊病例中检测显得非常重要。本文将重点对核酸P C R 检测方法(试剂盒)、基因测序方法进行分析。2 核酸P C R 检测核酸P C R 检测，是采用核酸P C R 试剂盒(主要包括引物、探针、阴性和阳性质控品)，可在普通荧光P C R 仪、数字P C R 仪上进行测定。2 1 核酸P C R 检测试剂盒该病毒核酸检测试剂盒需要根据S A R S C o V 2的序列进行设计，通过及时解析该病毒的全基因组序列，发现特异核酸序列，才能快速用于试

15、剂盒的研发1 引。科学地设计引物探针是开发荧光P C R 检测试剂盒的基础。疫情之初，多为针对W H O 和中国疾病预防控制中心(C D C)推荐的病毒区域进行设计，如根据新型冠状病毒的开放读码框l a b(o p e nr e a d i n gf l a m e，O R F l a b)、核壳蛋白(n u c l e o p r o t e i n，N)基因区域、小包膜糖蛋白基因区域(E 基因)的基因序列设计引物和探针。14 i。在设计过程中，应注意W H O 和C D C 推荐的检测区段并不一致，尽可能明确差异；除满足病毒的序列外，还需要设计荧光探针，即一段特异性寡核苷酸序列，两端有报告

16、荧光基团和淬灭荧光基团标记，为P C R 检测所必需。以下是中国疾病预防控制中心(C D C)推荐的基因序列。靶标T a r g e t1(o R F la b)：正向弓I 物(F)：C C C T G T G G G T T T T A C A C T T A A反向弓I 物(R)：A C G A T T G T G C A T C A G C T G A荧光探针(P)：5 -F A M。C C G T C r G C C G T A T(瓢A A A G G I T r A T G G B H Q l 3 靶标T a r g e t2(N)：正向弓I 物(F)：G G G G A A C

17、I r C T C C T G C T A G A A T反向引物(R)：C A G A C A 唧G C T C T C A A G C T G荧光探针(P)：5 F A M T F G C T G C T G C l T r G A C A G A，I T r T A M R A 3 由于各国各机构推荐和使用的新型冠状病毒核N 基因，另一部分试剂盒只检测O R F l a b 和N 基因，酸检测引物探针序列、荧光探针、检测扩增区域不试剂盒试剂对不同区域的敏感性存在差异。因此，同，试剂盒也会不同。如选择病毒核酸序列的不同这些不同会对后续的检测结果带来差异。所以，在区域进行检测，一部分试剂盒检

18、测O R F l a b 和E 及研制核酸试剂盒时，要选好其中的合成试剂及引物万方数据第4 l 卷第4 期王晶等：2 0 1 9 新型冠状病毒的核酸检测3 9 5探针、扩增区域等，优化好试剂，确保质控品质量。核酸检测试剂用于临床医疗体外诊断，需要通过3家以上独立临床医疗机构进行临床样本检测并出具临床应用数据报告，提供是否满足安全性、可靠性、有效性的证据。试剂盒中的质控品非常重要，需要同时有阴性和阳性质控品。目前有模拟病毒(如假病毒)、R N A、c D N A 等不同类型，选择质控品类型的不同对后续的核酸检测的结果会有一定影响。2 0 2 0 年1 月疫情暴发初期，6 个新型冠状病毒核酸检测试

19、剂盒(荧光P C R 法)通过了国家药监局应急审批程序获准，试剂盒中质控品类型有所不同。截至2 0 2 0 年3 月1 3 日，中国国家药品监督管理局应急审批新冠病毒检测试剂产品中核酸检测试剂盒有1 1 个。2 2 实时荧光R T-P C R 检测针对2 0 1 9 新型冠状病毒的核酸检测方法，目前应用的是实时荧光逆转录-聚合酶链反应(r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n，R T P C R)检测给予诊断u 1 I，该方法由一条R N A 单链转录为互补D N A(c

20、 D N A)称作“逆转录”(R T)，是将病毒R N A的逆转录(R T)和其c D N A 的P C R 相结合的方法。利用荧光信号积累实时监测整个P C R 进程，最后通过标准曲线或参比样本对模板中的目的D N A R N A片段进行定性分析。实验主要包括标本采集收集、标样处理、核酸提取、P C R 检测和结果分析等过程。在保证进入P C R 检测前每个过程都正确的前提下，进行P C R 反应。P C R 反应前，首先在反应体系中通过逆转录酶将标本中所含有的新型冠状病毒核酸(R N A)逆转录为c D N A，D N A 聚合酶的外切酶活性将探针酶切降解，荧光探针的报告基团与淬灭基团分离

21、，发出荧光；通过荧光P C R 仪测定荧光到达的循环数(c t值)，一个荧光分子对应一条扩增的D N A 链；最后分析获得的C t 值，它与病毒核酸含量浓度直接相关，病毒核酸浓度越低，c t 值越大。不同试剂盒产品都会有阳性质控品，并规定产品的C t 值的阳性检测结果判断值；没有检测出病毒R N A，代表阴性检测结果；检测出病毒R N A，代表阳性检测结果。由于R T P C R 方法为相对方法，参考P C R 方法相关报道1 1 5 9 I，以下问题需要注意：(1)逆转录中的背景影响；(2)标本间背景和质控品的不同将影响P C R 的扩增效率和响应，从而引入偏差；(3)低拷贝数的目标c D

22、N A 分子不能通过扩增检测到；(4)标本提取时引人D N A 溶液的杂质或者R N A 降解会影响P C R 动态扩增过程，会受抑制物标本的挑战。所以，检测过程中难免会出现准确性和一致性的问题。导致大家常说的”假阴性”、”弱阳性”等。检测中最好选用合适浓度和合适类型的标准物质作为量值确定的质量控制标准，减少不确定性，提高准确性，使检测c t 值保持在相对稳定准确的范围。2 3 数字P C R 检测为克服P C R 相对方法的缺点，数字P C R(d i g i t a lp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n，d P C R)是继P C R 后

23、发展起来的核酸定量方法，受P C R 扩增效率的变化影响不敏感，不需要采用标准物质或者外标进行单分子定量，实现了单分子D N A 的绝对定量。解决了q P C R使用标准曲线会对测量结果产生影响的问题，并且通过减少q P C R 方法中的基体效应，提高低丰度靶标D N A 的扩增灵敏度旧引，解决单D N A 模板出现在反应室而未被检出的情况0 1 6 。目前微滴数字P C R(d r o p l e td i g i t a lp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n，d d P C R)作为发展的数字P C R 技术得以应用。通过微滴处理技术，将

24、目标核酸分子包埋在独立的、体积确定的纳升级油包水液滴中，每个微滴都作为一个独立的P C R 反应器。P C R 反应可以在标准的热循环仪中进行，经P C R 扩增后，采用微滴分析逐个对每个微滴进行检测，根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算给出待检D N A 分子的拷贝数浓度，无需标准物质即可给出样本的拷贝数浓度而非c t 值，即可确定低至单拷贝的目标核酸分子的绝对数目。与定量P C R 方法相比，数字P C R 分析的优点是不依赖外部标准的绝对定量以及对引物和探针序列不匹配的相对不敏感，可对质粒D N A 和突变基因准确测量2 1 2 2 ，对临床标本中H I V D N A 检测23|、

25、环境性肠病低浓度宿主m R N A 的检测J、疱疹病毒6型旧5|、人畜共患病病原菌旧刮等检测，提高了对病毒等检测的灵敏度和精度。因此，为弥补实时荧光R T-P C R 检测相对方法的不足，数字P C R 检测方法作为一种绝对方法，在病毒载量低的情况下，可提高病毒2 0 1 9 n C o V S A R S-C o V-2 核酸分子检出率；并可用于验证2 0 1 9-n C o V S A R S C o V-2 的R T-P C R 检测方法的结果2 7 埘。2 4 核酸检测结果判定新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第五版)(简称”指南”)中，核酸检测实时荧光R T P C R 方法

26、，主要是对O R F l a b 和N 两个靶标进行测定。采用同一份标本进行检测，当实时荧光R T P C R检测的这两个靶标出现结果均为阳性时，确认为阳性万方数据计量学报2 0 2 0 年4 月病例；若单个靶标是阳性检测结果，需要重新进行实验，从采样开始再次进行实时荧光R T P C R 检测，检测结果依旧是单个靶标阳性检测结果，则确认为阳性。第二种现象是，当以两种标本进行实时荧光R T P C R 检测同时出现单靶标阳性结果，确认为阳性病例；当同种类型标本经过2 次采样检测，2 次单个靶标均为阳性检测结果，可判定为阳性病例。当出现核酸检测结果阴性时，为防止判定错误，需要对检测的影响因素进行

27、认真排除，避免产生假阴性。产生假阴性的主要因素包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本采样质量不好，有的病毒量底；样本收集时间把控不好，过早或过晚；保存、运输和处理样本不正确操作；检测中技术问题的原因，如没有考虑到病毒变异、P C R 抑制等。当出现不可确定的可疑情况，应采用多种方法重复实验，或采用敏感度更高的方法，如数字P C R 方法进一步确定旧川。当根据指南C t 值判断时，规定的是无C t 值或C ti 4 0 结果判断为阴性结果；C t 值 3 7，为阳性；当C t值在3 7 4 0 灰度区间时，建议重复做实验，若重做结果c t 值 4 0，扩增曲线有明显起峰，则判断该标本为阳性

28、，否则为阴性结果J。需要强调的是，对病毒量低的标本进行病毒2 0 1 9 n C o V S A R S C o V-2 核酸检测，特别是潜伏期、疑似病例人员，更加需要仔细了解试剂盒的检出限进行实验；应结合标本可能的病毒量选择具有不同检出限的试剂盒，并在检测时注意影响因素，并可使用数字P C R 方法进一步确定，避免由于病毒量少而检不出的现象，最终获得准确的检测结果。3 基因测序通过P C R 分子检测技术可以对大部分特异性很好的病原微生物进行检测，但是也存在有一些罕见病原体不能检测出来的情况；而且P C R 技术对引物的要求很严格，设计出的引物可能不能很好地匹配模版，从而导致结果的敏感性和特

29、异性降低旧1|。在对未知的标本进行检测时，如果没有病原微生物的核酸序列信息，就无法设计特异的引物和探针，核酸P C R 检测也就无法实现。近些年来随着测序通量的不断发展，成本的不断降低，高通量测序技术在病原微生物检测方面取得了很多成果2 33|。宏基因组测序(m e t a g e n o m i c sn e x tg e n e r a t i o ns e q u e n c i n g，m N G S)是对标本中核酸片段进行测序、生物信息分析和数据库比对，进而实现对病原微生物鉴定。从理论上来说，宏基因组测序能够对临床样本中的所有核酸组分进行完全无偏倚的扩增J，得出标本中所包含的病原微生

30、物相关序列信息。在针对特定临床样本的检测中，先通过核酸提取试剂盒提取标样中的D N A 或R N A，标本处理后完成文库构建，制备成测序仪可以识别和分析的D N A 文库，之后在测序仪上对核酸序列进行检测，进行生物信息学分析，得到样本中所包含的病原的相关信息。可以通过基因测序确定可能性最大的病原，为临床诊断提供与病毒病原的同源依据，同时测序信息还可以揭示其它呼吸道病菌感染的可能。在应用R T-P C R 检测方法对2 0 1 9 一n C o V S A R S-C o V-2 疑似病毒感染患者进行筛查和确诊时，为弥补R T-P C R 检测的不足，基因测序则可用于对R T P C R检测阴性

31、但仍疑似的病人再次补充复核，通过核酸测序检测其序列是否与已知的新型冠状病毒高度同源一J，作为确诊的判断标准，为临床诊断提供更多参考依据。新型冠状病毒2 0 1 9 n C o V 核酸检测试剂盒一联合探针锚定聚合测序法，2 0 2 0 年1 月2 6 日正式通过了国家药监局应急审批程序，获准上市进行基因测序检测，作为R T P C R 方法的补充，更准确地检测新型冠状病毒。另外，通过采用高通量测序检测开展病原核酸序列分析，在疫情之初多个研究团队H 3 纠使用高通量测序的方法对肺炎病患进行了研究分析，通过对患者的支气管肺泡灌洗液(B A L F)标本提取R N A 进行深度测序，拼接出了病毒的全

32、基因组序列，还根据病毒序列得到了很多关于病毒结构以及进化关系上的信息。宏基因测序为此次传染病疫情的确定、新型冠状病毒诊断工具及疫苗的研制提供了重要基础一1。检测中需要避免宏基因组二代测序技术存在的缺点，比如在进行人源样本检测时，会检测到人体宿主的核酸序列，可能会对生物信息分析造成影响；相比于P C R 技术，检测时间相对长，成本也高。随着测序成本的降低及技术的优化，高通量测序技术在临床上的应用会越来越广泛 1|。4展望依靠新型冠状病毒核酸R T P C R 检测，以及病毒基因测序与已知的新型冠状病毒高度同源作为临床确诊的主要依据，对防控疫情取得了较好的成效。然而核酸检测也有其局限性，分子诊断中

33、由于产品检测限、样品采集和检测过程质量控制问题，出现检测不准确和假阴性很难避免，同时也存在不同品牌产品的核酸试剂盒R T P C R 分析方法检测结果会有不同。为应对病毒疫情的发生，生物分析检测已是重要的手段，有必要协调多方核酸检测力量来实现检测网路工万方数据第4 1 卷第4 期王晶等：2 0 1 9 新型冠状病毒的核酸检测作3 I，加强检测质量控制，并期待有其它的快速方法如快速核酸检测技术、恒温扩增一实时荧光、杂交捕获免疫荧光技术、依赖核酸序列扩增技术(N A S B A 技术)、环介导等温扩增技术(L A M P 技术)、增强型荧光实时P C R(E R T P C R)技术以及抗原抗体技

34、术等可以被用于大规模的人群筛查，发现”无症状感染者”，控制病毒的传播6|。随着2 0 1 9 n C o V S A R S-C o V-2 疫情的变化以及流行病学调研的推进，空气中病原安全监测将会进人常态，实现对病原的常规监测，P C R 方法和基因测序方法可作为互补很好地进行检测；同时需要进一步加强空气中宏基因组测序技术的研发应用，以及发展纳米孔单分子直接R N A 测序等技术作为进行病原测序的手段，直接、狈4 量病毒R N A 碱基的修饰7 j。实现监测新型冠状病毒在传播过程中可能会发生的变异，这对病毒的防控具有重要意义。为提高检测试剂盒产品的质量，加强标准的应用并加以规范和重视质量评价

35、是当务之急，通过建立生物计量与质量控制标准体系进行评价。如对于核酸检测，试剂盒产品的生产质量对检测结果可靠性非常关键，建议依据G B T3 7 8 6 8-2 0 1 9 核酸检测试剂盒溯源性技术规范、G B T3 7 8 7 1-2 0 1 9 核酸检测试剂盒质量评价技术规范、G B T3 7 8 7 5-2 0 1 9 核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范，加强对试剂盒产品质量提升进行评价；另外开展检测能力的评价，以提高试剂和检测应用质量，通过建立的核酸量值溯源传递体系，使用合适类型的国家标准物质和标准流程进行评价。对病毒检测，模拟病毒核酸标准物质可通过分析全程进行控制，首先确保检测的准确；

36、再结合临床诊断检测流程质量控制和体外诊断的规定满足临床检验需要。面对此次痰隋，中国计量科学研究院已研发了病毒高灵敏数字P C R 检测方法和2 0 1 9 一n C o V 检测试剂盒，以及新型冠状病毒体外转录R N A 标准物质。由于生物威胁因子的防控是长期任务，我们正通过主持承担的”生物安全关键技术研究”国家重点研发专项项目生物安全相关核心计量技术和标准物质研究(2 0 1 8 Y F C l 2 0 0 5 0 0)，围绕重要新发突发传染病、烈性传染病等重要生物威胁因子，建立核酸、蛋白质、微生物测量技术，从多种类型标准物质制备与计量校准、生物样本质量控制等层次建立可靠的关键技术，建立标准

37、规范，形成生物安全相关重要生物计量测量传递体系，开展示范应用，以满足国家生物安全对生物威胁因子的监控需求，维护国家利益和保障人民生命安全。参考文献1 L u oGX，G a oSJ G l o b a lH e a l t hC o n c e r nS t i r r e db yE m e r g i n gV i r a lI n f e c t i o n s J J o u r n a lo fM e d i c a lV i r o l o g y，2 0 2 0，9 2：3 9 9 3 4 0 2 L uRJ，Z h a oX，“J，e ta 1 G e n o m i cC h

38、 a r a c t e r i z a t i o na n dE p i d e m i o l o g yo f2 0 1 9N o v e lC o r o n a v i r u s：I m p l i c a t i o n sf o rV i r u sO r i g i n sa n dR e c e p t o rB i n d i n g J 舭L a n c e t，2 0 2 0，3 9 5(1 0 2 2 4)：5 6 5 5 7 4 3 C h e nY，L i uQY，G u oDY E m e r g i n gC o r o n a v i r u s e s

39、：G e n o m eS t r u c t u r e，R e p l i c a t i o n，a n dP a t h o g e n e s i s J JM e dl 矗r o l，2 0 2 0，9 2(4)：4 1 8 4 2 3 D O I：1 0 1 0 0 2 j m v 2 5 6 8 1 4 W uF，Z h a oS，Y uB，e ta l，An e wc o r o n a v i r u sa s s o c i a t e dw i t hh u m a nr e s p i r a t o r yd i s e a s ei nC h i n a J N

40、a t u r e，2 0 2 0 D O I：1 0 1 0 3 8 s 4 1 5 8 6 0 2 0 2 0 0 8 3 5 C h a nJF，Y u a nSF，K o kKH，e ta 1 Af a m i l i a lc l u s t e ro fp n e u m o n i aa s s o c i a t e dw i t ht h e2 0 1 9n o v e lc o r o n a v i r n si n d i c a t i n gp e r s o n-t o-p e r s o nt r a n s m i s s i o n：as t u d yo

41、faf a m i l yc l u s t e r J T h eL a n c e t，2 0 2 0，3 9 5(1 0 2 2 3)：5 1 4 5 2 3 6 L iXG，Z a iJJ，W a n gXM，e ta 1 P o t e n t i a lo fl a r g ef i r s tg e n e r a t i o n h u m a n t o h u m a nt r a n s m i s s i o no f2 0 1 9-n C o V J J o u r n a lo fM e d i c a lV i r o l o g y，2 0 2 0，9 2：4

42、4 8 4 5 4 7 C h e nLJ，“uwY，Z h a n gQ，e ta 1 R N AB a s e dm N G SA p p r o a c hI d e n t i f i e saN o v e lH u m a nC o r o n a v i r u sf r o mT w oI n d i v i d u a lP n e u m o n i aC a s e si n2 0 1 9W u h a nO u t b r e a k J E m e r gM i c r o b e s1 f e c t，2 0 2 0，9(1)：3 1 3 3 1 9 d o t：1

43、 0 1 0 8 0 2 2 2 2 1 7 5 1 2 0 2 0 1 7 2 5 3 9 9 8 P h a nT N o v e lc o r o n a v i r u s：F r o md i s c o v e r yt oc l i n i c a ld i a g n o s t i c s J I n f e c tG e n e tE v o l，2 0 2 0，7 9：1 0 4 2 1 1 9 X i eXZ，Z h o n gZ，Z h a oW，e ta 1 C h e s tC Tf o rT y p i c a l2 0 1 9-n C o VP n e u m

44、 o n i a：R e l a t i o n s h i pt oN e g a t i v eR T-P C RT e s t i n g J R a d i o l o g y，P u b l i s h e dO n l i n e：F e b1 22 0 2 0 h t t p s：d o t o r s 1 0 1 1 4 8 r a d i 0 1 2 0 2 0 2 0 0 3 4 3 1 0 L a g iF，P o l l i n iS，Z a m m a r c h iL C l i n i c a lr o l e o fv i r a li d e n t i f

45、i c a t i o nb yap o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n-b a s e dd i a g n o s t i cp a n e li na d u l t sh o s p i t a l i z e dw i t hc o m m u n i t y a c q u i r e dp n e u m o n i a J I n t e r n a la n dE m e 曙e n c yM e d i c i n e，2 0 2 0 h t t p s：d o t o r g l O 1 0 0 7 s l1 7 3 9 0

46、2 0-0 2 2 8 2-7 1 1 C o r m a nVM，L a n d tO，K a i s e rM，e ta 1 D e t e c t i o no f2 0 1 9n o v e lc o r o n a v i r u s(2 0 1 9 一n C o V)b yr e a l t i m e R T P C R J E u r oS u r v e i l l，2 0 2 0，2 5(3)：2 0 0 0 0 4 5 1 2 中华人民共和国国家卫生健康委员会新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)E B O L h t t p：n w n h c g o v c,V y

47、z y s i 1 3 C D C R e a l T i m eR T P C RP a n e lf o rD e t e c t i o n2 0 1 9 一N o v e lC o r o n a v i r n s E B O L h t t p s：w w w c d c g o v c o r o n a v i m s 2 0 1 9-n c o v l a b r t p c r d e t e c t i o n i n s t r u c t i o n s h t r n l 1 4 中国疾病预防控制中心病毒预防控制所新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列 E B O L

48、h t t p：i v d c c h i n a c d c c n k y j z 2 0 2 0 0 1 t 2 0 2 0 0 1 2 1 _ 2 11 3 3 7 h t m l 1 5 B u m sM，B u r r e l lA，F o yC T h ea p p l i c a b i l i t yo fd i g i t a lP C Rf o rt h ea s s e s s m e n to fd e t e c t i o nl i m i t si nG M Oa n a l y s i s J E u rF o o dR e sT e c h n o l，2

49、0 1 0，2 3 1(3)：万方数据3 9 8计量学报2 0 2 0 年4 月3 5 3 3 6 2 1 6 C o r b i s i e rP，B h a tS，P a r t i sL，e ta 1 A b s o l u t eq u a n t i f i c a t i o no fg e n e t i c a l l ym o d i f i e dM O N 8 1 0m a i z e(Z e am a y sL)b yd i g i t a lp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n J A n a lB i o a n a

50、 lC h e m，2 0 0 9，3 9 6(6)：2 1 4 3 2 1 5 0 1 7 H e y r i e sKA，T r o p i n iC，V a n I n s b e r g h eM，e ta 1 M e g a p i x e ld i g i t a lP C R J N a tM e t h o d s，2 0 1 1，8(8)：6 4 9 6 5 1 1 8 T e r r yCF，S h a n a h a nDJ，B a l l a mLD，e ta 1 R e a l-t i m ed e t e c t i o no fg e n e t i c a l