生物制药工艺学实验.docx

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1、生物制药工艺学实验指导（12个实验，36学时） 焦飞生物技术教研室实验一健胃消食片配方及片剂的制备一、实验目的1. 掌握压片机压片的方法及影响片剂成型的主要因素；2. 学会片剂处方的调配。二、实验材料和仪器太子参，陈皮，山药，麦芽（炒），山楂，蔗糖粉，糊精，硬脂酸镁，粉碎机，干燥箱，制片机三、实验原理健胃消食片为内科伤食类非处方药品，主治健胃消食，用于脾胃虚弱，消化不良，脾胃虚弱所致的食积，症见不思饮食，暖腐酸臭，脘腹胀痛。健胃消食片的配方如下，太子参228.6g，陈皮22.9g，山药171.4g，麦芽（炒）171.4g，山楂114.3g，蔗糖糊精适量，值得片剂为淡棕黄色的片或薄薄膜片，气略香

2、，味微甜，酸。制作方法：太子参半量与山药粉碎成细粉，其余陈皮三味药及剩余的太子参置于烧杯，加3倍量水，煎煮1小时，滤过，合并两次煎液，减压浓缩至浸膏，干燥。将蔗糖粉糊精和生药粉以3：1：1的混合粉与浸膏混合制成软材，软材的软硬应适当，以“手握成团，轻压则散”为宜。采用挤出制粒的方法制成颗粒，颗粒在60-80摄氏度干燥，干燥时应逐渐升温，以免因颗粒表面干燥过快结成硬壳而影响内部水分的蒸发。颗粒整粒后加入1硬脂酸镁混合后压片。四、实验步骤1. 称取太子参22.8g，陈皮2.3g，山药17.1g，山药17.1g，麦芽17.1g，山楂11.4g2. 太子参山药用粉碎机粉成细粉。3. 将上述药材放入烧杯

3、中，加入3倍量的水，煎煮半小时，重复两次，将上清液合并，减压浓缩至浸膏，将所得浸膏放入烘箱中80度干燥。4. 将蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以3：1：1的比例混合制成颗粒软材，将软材放入烘箱中逐渐升温干燥。5. 干燥后的软材加入1硬脂酸镁放入压片机中压片。实验二溶菌酶结晶的制备一、实验目的1. 掌握盐析法提取蛋白质的原理和过程；2. 学会溶菌酶的结晶和精制方法。二、实验材料与仪器新鲜鸡蛋，氯化钠，1 mol/L 氢氧化钠溶液，醋酸缓冲液，烧杯，玻璃棒，布氏漏斗，干燥箱。三、实验原理溶菌酶又称细胞壁质酶或N乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种国内外很紧销的生化物质，广泛应用于医学临床。具有多种药理作用，能抗

4、感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等，有抗菌的作用，常用于五官科多种粘膜炎症，皮肤带状疮疹等疾病。是优良的天然防腐剂，可用于食品的防腐保鲜。尤其重要的是近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶。四、实验步骤（1）收集鸡蛋清将新鲜鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（最好是新生的鸡蛋、PH值不得低于8，否则不能使用），按其体积的两倍量加入水，轻轻搅拌5min，使蛋清溶液的稠度均匀，注意在搅拌过程中不能起泡，搅拌不宜过快、搅拌棒应光滑等，以防蛋白质变性而影响溶菌酶产品的得率及质量，最后用双层细纱布滤除蛋清溶液中的脐带块及碎蛋壳等。（2）加入氯化钠 按每100ml蛋清溶液加入2g.氯化钠的比

5、例，白蛋清溶液中慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅拌，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。（3） 粗制溶菌酶 加完氯化钠细粉后， 再用1mol/L 的氢氧化钠溶液小心地将上述蛋清溶液的PH值调节到10.8。在用氢氧化钠溶液调节蛋清溶液PH值时，用胶头滴管将其逐渐滴入并不断搅拌以免局部过碱而导致蛋白质的变性，从而影响溶菌酶的得率和质量。为加速溶菌酶的结晶过程，可再加入适量的溶菌酶结晶体作为晶种。低温下静置数天，溶菌酶结晶将慢慢析出，于7296h 达到最高产率。待结晶完全后，倾去上清液并用布氏漏斗滤出结晶，即可得到粗制的溶菌酶晶体。（4

6、）精制溶菌酶 将制得的粗结晶用PH值4.6的醋酸溶解，然后让酶液静置2h，接着过滤除去不溶物，收集滤液并量出体积，按100ml滤液加5g氯化钠的比例加入（加入方法与第二步加入氯化钠的方法相同）。然后用1mol/L的氢氧化钠溶液缓慢地将其PH值调节到10.8 后，低温下静置结晶。为加速结晶过程可向酶液中加入溶菌酶晶种，待结晶完全后再倾去上清液，用布氏漏斗过滤可得溶菌酶结晶，如纯度不够，可重复操作提纯，直至达到所需要的纯度为止，结晶于3040:烘干后即得溶菌酶产品。（5）包装存贮 产品应装于玻璃或陶瓷容器中，置于阴冷处保存，以免溶菌酶受热后失去活性。注意事项（1）整个过程只能在玻璃或陶瓷容器中进行

7、，不可用金属容器，以免酶失活而影响产品的得率及质量。（2）操作的全过程要在低温下进行（10以下），防止原料变质和酶失活。（3）第三步中加入溶菌酶晶种的具体操作是将溶菌酶晶体均匀地悬浮于少量的PH值为10.8，浓度为5%氯化钠溶液中，取几滴加入到调好的PH值和氯化钠浓度的蛋清液内，再置低温处结晶。实验三 纤维素酶活力的测定一、实验目的1. 了解纤维素酶的种类和测定原理，以及纤维素酶的作用特性；2. 掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法。二、实验原理纤维素酶是一种多组分酶，包括4种组分：内切-1,4-葡聚糖酶、外切-1,4-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖酶（又称-葡

8、聚糖苷酶）。在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖等还原糖。这些还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成红棕色的氨基化合物，在540 nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。利用比色法测定其还原糖的量就可测定纤维素酶的活力。 由不同底物测得的酶活力分别称为FPA（滤纸糖酶活力）和CMCA（羧甲基纤维素酶活力）。为了统一标准，目前通常用滤纸作为纤维素酶作用的底物。纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色

9、反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。滤纸酶活力Filterp apera ctivity (FPA)指lg 固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1),指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH 6.0), lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。三、实验器材和试剂水浴锅、分光光度计、计时器、比色皿、移液管、吸耳球DNS试剂、柠檬酸缓冲液、葡萄糖标准储备溶液、快速定性滤纸四、实验内容1.葡萄糖标准曲线的绘制：取7支具塞刻度试

10、管，编号，按照表一规定的量，分别吸取葡萄糖标准液、缓冲溶液和DNS试剂于各管中，混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 ml，盖塞，混匀。在540 nm处测量吸光度，以葡萄糖量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。表一 葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量（ml）DNS试剂吸取量（ml）浓度（mg/ml）吸取量(ml)00.00.0023.011.00.501.53.021.50.501.53.032.00.501.53.042.50.501.53.053.00.501.53.063.50.501.53.02. 待

11、测酶液的制备（1）称取酶样1.0 g，用柠檬酸缓冲液溶解至100 ml（100倍），之后分别做200倍、400倍和800倍稀释,混匀。准确定容放置10 min，待测。（2）滤纸条的准备滤纸条事先干燥，水分平衡后，将滤纸折成宽1 cm，质量为50.5 mg的滤纸条，折成M型备用。（3）酶活力的测定取四支具塞试管，将折成M型的滤纸条分别放入每支试管底部，其中一支试管空白，分别向四支试管中加入缓冲液1.5 ml，待测酶液0.5 ml（空白管不加），使管内溶液浸没滤纸，盖塞。将四支试管同时置于50 水浴中，准确计时60 min，取出，立即向各管中加入DNS试剂3.0 ml。再于空白管中准确加入稀释好的

12、待测酶液0.5 ml，摇匀。将四支管同时放入沸水浴中，加热10 min，取出，迅速冷却至室温，加水定容至25 ml，摇匀。以空白管（对照液）调仪器零点，在540 nm下，测量三支平行管中样液的吸光度，取平均值。以平均值查标准曲线或用回归方程求出还原糖含量。（4）酶活力的计算纤维酶活力按以下公式计算：X=A1/0.5n式中，X-样品的滤纸酶活力，u/g；A-根据吸光度在标准曲线上查得的还原糖量，mg；n-酶样的稀释倍数。实验四金银花、黄芩、川芎和连翘浸膏的制备一、实验目的1掌握提取方法及操作要点。2熟悉提取率的测定方法。3. 了解总浸膏量中总黄酮量和总有机酸量的测定方法。二、实验原理浸膏剂指用适

13、宜溶剂与方法提取中药中有效成分，蒸去全部溶剂，调整浓度至规定标准所制成的膏状或粉状的固体制剂。除另有规定外，浸膏剂毎1g相当于原有药材的25g。浸膏剂一般用煎煮法或渗漉法制备。煎煮法指将药材加水煎煮取汁的方法，一般过程为取规定药材，切碎或粉碎成粗粉，置适宜煎器中，加水浸没药材，浸泡适宜时间后，加热至煮沸，保持微沸一定时间，分离煎出液，药渣依法煎出数次（一般为23次），至煎液味淡为止，合并各次煎出液，浓缩至规定浓度。煎煮法适用于有效成分能溶于水，且对湿、热均稳定的药材。渗漉法是将适度粉碎的药材置渗漉筒中，由上部不断添加溶剂，溶剂渗过药材层向下流动过程中浸出药材成分的方法。适用于贵重药材、毒性药材

14、及高浓度制剂。三、实验材料与器材金银花、黄芩、川芎、连翘、酚酞试剂、NaOH滴定液、0.6%Mg(Ac)2甲醇溶液索氏提取仪、回流冷凝管、加热套、水浴锅四、实验内容1. 金银花提取取最粗粉金银花、黄芩、川芎、连翘各20 g，加入200 ml蒸馏水，按煎煮法，煎煮3次，每次30 min，取上清液或过滤取滤液。2. 浸膏制备：将滤液浓缩至稀糖浆状，静置2 周，过滤，即得浸膏。3. 质量检查（1）观察浸膏的外观性状，本品在水浴上蒸干后，在105干燥3小时，至恒定，测定测定总浸膏量。（2）含量测定 总有机酸的测定：在供试品溶液中加入酚酞试剂2滴，用标定好的0.0749 mol/L的NaOH滴定液滴定至

15、溶液显粉色。毎1 ml NaOH滴定液相当于9.916 mg的水杨酸，总有机酸量以水杨酸计。总黄酮的测定：按中药化学中芦丁测定方法，0.6%Mg(Ac)2甲醇溶液为参比，于510nm处测定各溶液吸光值。实验五金银花、黄芩、川芎和连翘浸膏的纯化及丸剂的制备一、实验目的1.掌握泛制法、塑制法制备丸剂的方法与操作要点。 2.熟悉水丸、蜜丸、滴丸对药料和辅料的处理原则及各类丸剂的质量要求。二、实验原理丸剂是根据中医辨证论治的原则组方。碾研成细末，混合均匀后，根据处方用蜜、水、黄酒、醋、面糊、米糊、蜂蜡、药汁、流浸膏、糖浆等为粘合剂，制成圆球形的内服固体剂型，如蜜丸、水丸、糊丸、蜡丸、浓缩丸等，以治疗疾

16、病的一种疗法。丸剂的制法有泛制法、塑制法和滴制法。泛制法适用于水丸、水蜜丸、糊丸、浓缩丸的制备，其工艺流程为：原、辅料的准备起模成型盖面干燥选丸质量检查包装。塑制法适用于蜜丸、浓缩丸、糊丸、蜡丸等的制备，其工艺流程为：原、辅料的准备 制丸块制丸条分粒、搓圆干燥质量检查包装。供制丸用的药粉应为细粉或极细粉；起模、盖面、包衣的药粉，应根据处方药物的性质选用。丸剂的赋形剂种类较多，选用恰当的润湿剂、黏合剂，使之既有利于成型，又有助于控制溶散时限，提高药效。水丸制备时，根据药料性质、气味等可将药粉分层泛入丸内，掩盖不良气味，防止芳香成分的挥发损失，也可将速效部分泛于外层，缓释部分泛于内层，达到长效的目

17、的。一般选用黏性适中的药物细粉起模，并应注意掌握好起模用粉量。如用水为润湿剂，必须用8小时以内的凉开水或蒸馏水。水蜜丸成型时先用低浓度的蜜水，然后逐渐用稍高浓度的蜜水，成型后再用低浓度的蜜水撞光。盖面时要特别注意分布均匀。泛制丸因含水分多，湿丸粒应及时干燥，干燥温度一般为80左右。含挥发性、热敏性成分，或淀粉较多的丸剂，应在60以下干燥，。丸剂在制备过程中极易染菌，应采取恰当的方法加以控制。 5.滴丸的冷却剂必须对基质和主药均不溶解，其比重轻于基质，但两者应相差极微，使滴丸滴入后逐渐下沉，给予充分的时间冷却。否则，如冷却剂比重较大，滴丸浮于液面；反之则急剧下沉，来不及全部冷却，滴丸会变形或合并

18、。三、实验材料与仪器金银花、黄芩、川芎、连翘、蜂蜜、纯化水培养皿、小型制丸机四、实验内容1.水丸的制备：金银花、黄芩、川芎、连翘以上4味，各取5g，混合粉碎成细粉，混匀。起模：即起母子。可采用药匾手工法或包衣锅机械法。手工法是以小扫帚蘸少许开水，或其他粘合剂均匀地刷在药匾上，然后撒上少量药粉，转动药匾，使药粉全部湿润，再用干燥棕刷轻轻将药粉刷离，经过再刷水，加药粉，旋转药匾，如此反复多次，使颗粒逐渐呈圆形而增大，过药筛选取均匀的颗粒作为母子。机械法则以包衣锅代替药匾起模，其操作方法与手工法基本相同。逐渐加大制成符合要求的丸剂。手工法泛丸是母子的基础上泛丸：将筛选的母子。继续用药匾，经过喷水，撒

19、药粉，利用旋转、推拉、揉滚、翻摆等操作，反复进行，使药丸加大到一定水平，过筛，即可制成均匀光滑一致的水泛丸。机器泛丸基本操作与手工法相同。干燥：水丸制成后应将其摊布容器中，于阴凉通风处及时干燥，并应随时加以翻动。或用低温烘干。2.蜜丸:将药材细粉用蜂蜜为粘合剂制成的丸剂。分为大蜜丸及小蜜丸两种。蜜丸操作主要为炼蜜、丸块及丸条制备、丸剂分割与搓圆、干燥、包衣等几个步骤。炼蜜：将蜂蜜置于锅中加热熬炼。捞出漂浮物及浮沫以去除其中的杂质，并可杀死微生物，破坏酵素，适当减少水分含量，增加粘合力，以适合制丸要求。炼蜜依据熬炼时间长短；分为嫩蜜、中蜜(亦称炼蜜)老蜜3种二炼蜜水平按药物性质和季节而定，嫩蜜、

20、炼蜜适用于粘性较强的药材，老蜜则适用于粘性差的矿物或纤维性较多的药材；冬季多用嫩蜜，夏季多用老蜜。加入炼好的蜂蜜丸块及丸条制备：少量制备时将药物细粉置于清洁的容器内。混合均匀，制成软硬适宜的可塑性丸块，然后搓制成粗细一致的丸条。大量生产时，则用机械完成丸块及丸条制备。可以手工制丸或机械制丸。手工制丸按预定规格将丸条掐成均匀颗粒 丸剂分割与搓圆：丸条制成后。搓圆即成。机械制丸是丸条制成后自动切割，搓揉，滚圆。干燥方法多用烘干法干燥：大蜜丸机蜜丸一般应干燥后贮存。以丸粒互不粘连，不粘手，手捏之不易变形为度。如不需干燥则以蜡皮包裹贮存。实验六植物油/-环糊精包合物的制备一、实验目的1掌握饱和水溶液法

21、制备包合物的工艺；用单凝聚法制备微囊的方法。2熟悉环糊精的性质及包合物的其他制备方法；熟悉影响成囊的因素及控制方法。3了解环糊精包合物的应用。二、实验原理环糊精（cyclodextrin，CYD）是一种新型的水溶性包合材料，是淀粉经酶解得到的一种产物。这些分子中有613个葡萄糖分子以1，4糖苷键连接而成的环筒状结构的低聚糖化合物，其分子结构中具有一定大小的空穴，有环筒内疏水、环筒外亲水的特性。环糊精包合物是指借助分子间的作用力（包括静电引力、氢键、偶极子间引力等），药物分子包含或嵌入环糊精的筒状结构内形成的超微粒分散物。形成的包合物服用后在体内经渗透、扩散、竞争性置换等作用释放出药物分子而发挥

22、药效。环糊精包合能将一种液体物质转变成一种固体复合物并且固定芳香物质和挥发性物质。环糊精包合物制备方法很多，有饱和水溶液法、研磨法、喷雾干燥法、冷冻干燥法等，可根据环糊精和药物的性质，结合实际生产条件加以选用。药物制成包合物后可增加药物的稳定性，增加难溶性药物的溶解度与溶出速度，提高药物的生物利用度，掩盖药物的不良嗅味，降低药物的刺激性，还可使液体药物粉末化以便制剂，有些包合物还可作为缓释和靶向制剂的药物载体。微型胶囊（简称微囊）是利用天然、半合成或合成的高分子材料（通称囊材），将固体或液体药物（通称囊心物）包裹而成直径5m250m的微小胶囊。药物微囊化后，稳定性增加，并呈固体粉末状，可供制备

23、散剂、胶囊剂、片剂、注射剂及软膏剂等使用。微囊的制备方法很多，可归纳为物理化学法、化学法及物理机械法等。本次实验采用物理化学法中的单凝聚法和复凝聚法。本实验利用两种具有相反电荷的高分子材料作囊材，将囊心物分散在囊材的水溶液中，在一定条件下，相反电荷的高分子材料互相交联形成复合物后，溶解度降低，自溶液中凝聚析出成囊。本实验所用阿拉伯胶带负电，而A型明胶在等电点以上带负电，等电点以下带正电。如果将待包的药物先与阿拉伯胶制成乳浊液或混悬液，然后在一定温度下与等量明胶溶液混合，用醋酸调pH在4.0-4.1左右，则明胶带正电，与带负电的阿拉伯胶相互凝聚而包在药物周围，成为微囊。三、实验仪器与药品显微镜（

24、1040倍）、500ml烧杯、乳钵、温度计、水浴、布氏漏斗、100ml量筒、10ml量筒、蒸发皿、阿拉伯胶、明胶、37%甲醛、10%醋酸、10%氢氧化钠四、实验内容与操作1.薄荷油-环糊精包合物【处方】 -环糊精 4g植物油 1mL（28d）蒸馏水 50mL【制法】称取CYD 4g，置100mL锥形瓶中，加入蒸馏水50mL，加热溶解，降温至50，精密滴加植物油1mL，恒温搅拌2.5小时。冷藏24小时，待沉淀完全后过滤。用无水乙醇5mL分三次洗涤沉淀3次，至沉淀表面近无油渍，将包合物置干燥器中干燥，即得。2.植物油微囊【处方】植物油 1.0g 10%醋酸 适量 明胶 2.5g 20%氢氧化纳液

25、适量阿拉伯胶 2.5g 硬脂酸镁 适量37%甲醛 1.25ml 蒸馏水 适量【制法】取阿拉伯胶2.5g，使溶于50ml蒸馏水中（60），加入植物油1.0g于组织捣碎机中乳化1分钟。将之转入500ml烧杯并放入50恒温水浴锅中。另取明胶2.5g，使溶于6050ml蒸馏水中。将明胶液在搅拌下加入上述乳浊液中，用10%的醋酸调pH4.1左右，显微镜下观察见到油珠外层有一层薄薄的膜，即已成囊（此时囊形并不圆整，大小不一）。加入蒸馏水200ml（温度应不低于30），不断搅拌直到10以下。加入37%甲醛1.25ml（以蒸馏水1.25ml稀释），搅拌15分钟，用20氢氧化钠液调pH89，继续搅拌冷却半小时，

26、除去悬浮的泡沫，滤过，用水洗涤至无甲醛臭，pH中性即可。抽滤，加硬脂酸镁制粒，过一号筛，于50烘干，即得。五、注意事项1成囊时pH调节不要过高或过低，一般调pH至4.0左右，此时明胶全部带正电荷。2.搅拌速度要适宜。速度过快，囊膜易破坏，过慢则微囊易粘连。速度不一，则成囊大小不均匀。3.加入甲醛使囊膜变性，用量多少直接影响变性程度。用10%氢氧化钠调pH=8。搅拌30min，以增加甲醛与明胶的交联作用，使凝胶的网状结构孔隙缩小。六、思考题1.制备包合物的关键是什么？2.本实验为什么选用环糊精为主分子？它有什么特点？3除饱和水溶液法外，制备包合物的方法还有哪些？4试举例说明包合物在药物制剂中的应

27、用。实验七植物油/-环糊精包合物的质量检查一、实验目的1掌握环糊精包合物和微囊的质量检测方法。2熟悉药物溶出度的测定方法。二、实验原理影响包合物的因素包括内因和外因。内因：主、客分子的大小；客分子的极性。外因：温度、附加剂、PH等。为获得最佳制备工艺，以包合物的收得率、包合物中药物的含量为评价标准，几种质量评价方法：显微镜法和电镜扫描法溶解度和溶出度法、紫外分光光度法、荧光光度法、红外分光光谱法、差示热分析法、X射线衍射法、核磁共振法。通过比较包合前后紫外吸收光谱图，根据吸收峰的位置和高度来判断包合是否成功或包合前后主要成分是否发生变化。目前微囊的质量评价，除制成的制剂本身要求应符合药典规定外

28、，还包括下述内容：（一）形态、粒径及其分布，可采用光学显微镜、扫描或电子显微镜观察形态并提供照片。微囊形态应为圆整球形或椭圆形的封闭囊状物，微球应为圆整球形或椭圆形的实体；（二）药物的含量微囊、微球中药物含量的测定一般采用溶剂提取法。溶剂的选择原则是：应使药物最大限度地溶出而最小限度地溶解载体材料，溶剂本身也不应干扰测定。（三）药物的载药量与包封率，对于粉末状微囊，先测定其含药量后计算载药量；对于混悬于液态介质中的微囊，先将其分离，分别测定液体介质和微囊的含药量后计算其载药量和包封率。三、实验仪器与药品电子天平、显微镜（1040倍）、溶出仪四、实验内容1. 包合物质量检查（1）性状 包合物为白

29、色干燥粉末，无明显的植物油气味。（2）重量：称量包合物的总质量，计算得率。2. 微囊的质量评价主要检查胶囊内容物微胶囊的粒度分布、显微观察、总油及表面油。（1）微胶囊的显微镜观察取一滴固化后的微胶囊溶液，将其放于载玻片上，用显微镜观察并测量其粒径大小。（）溶出度：量取200 ml蒸馏水，注入每一个测定容器内，加热使溶剂温度保持在370.5，调整转速使其稳定，取微囊试样置于管内，然后进行测定。实验八 金霉素链霉菌培养基的制备一、实验目的1. 学会链霉菌种子培养基和发酵培养基的配制；2. 掌握实验室高压湿热灭菌的方法。二、实验原理金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦

30、称“金色链霉菌”， 放线菌门(Actinobacteria)， 放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。在固体培养基上产生金色色素，故名。其菌落为草帽型, 菌落直径一般为35毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。菌落开始为白色，长孢子后变青色。抗菌素工业上用以生产金霉素。放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。放

31、线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。因其生长具辐射状，故名放线菌。放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。但其菌落较小而致密，不易挑取。不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制

32、取的一类广谱抗生素。抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。三、实验材料与器材1ml移液枪、铝锅、电炉NaBr母液（0.1gml）、KCl母液（0.1gml）、M-促进剂母液（2.5mgml）四、实验步骤1种子培养基 种子培养基(gL)：可溶性淀粉40，黄豆饼粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4， (NH4)2SO4 3，MgSO47H2O 0.25，KH2PO4 0.25。先称取黄豆饼粉20g，单独煮沸10分钟，加入少量凉水降温，4层纱布压榨取汁，与其它称好的各成分混合，定容至1L。每50ml分装到250ml三角瓶中，每

33、组2瓶。2定向发酵培养基发酵培养基(gL)：可溶性淀粉100，黄豆饼粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，酵母粉2.5， (NH4)2SO4 3，MgSO47H2O 0.25，淀粉酶0.1。配制方法同种子培养基，配好后分装到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分别加入如下成分，比较它们对四环素产量的影响：对照(不加其他成分)；加入NaBr母液至终浓度为2gL；加入KCl母液至终浓度为2gL；加入NaBr母液至终浓度为2gL及M-促进剂母液至终浓度为0.025gL。每组各配一瓶。3灭菌将封好口的培养基121灭菌30min。同时灭1ml 剪口移液枪头。（总过程：称量溶化定容分装封口灭菌）五、注意事项

34、1黄豆饼粉煮沸取汁。2培养基封口最好用8层纱布或棉花塞，最好不用橡胶塞，以增加透气性。3灭菌时锅内要补足水分。由于灭菌锅较大，升温排气一定要充分（10min）。六、补充阅读工业发酵中利用生产菌发酵得出最终产物是一个逐级放大的过程，各个不同的阶段对于营养成分的要求也各有特点，根据发酵不同阶段的要求，培养基可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。 孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是：第一，营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。如灰

35、色链霉在葡萄糖硝酸盐其它盐类的培养基上都能很好地生长和产孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。第二，所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。第三，要注意孢子培养基的pH和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高

36、些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。最后一级的种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。 发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所

37、必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。实验九 金霉素链霉菌的定向发酵一、实验目的1. 学习和掌握无菌操作技术。2. 掌握定向发酵四环素的原理。二、实验原理定向发酵是指通过改变培养基组分(加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的产物。金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：R1R2金霉素ClH土霉素HOH四环素HH金霉菌原是产生金霉素（Chlortetracycline）的菌种，但因金霉素比四环素只多

38、一个氯离子，所以只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。另外，金色链霉菌在30以下时，合成金霉素的能力较强；当温度超过35时则只合成四环素。本实验中，利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制剂作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M-促进剂，分子式：C7H5NS2，通常作为橡胶硫化促进剂)抑制氯化酶的作用，从而增加四环素的产量。三、实验材料和试剂金霉素链霉菌（购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心）、M-促进剂、麸皮、K2HPO4、MgSO47H2O、（NH4）2HPO4、琼脂四、实验步骤1. 配制斜面培养基（1）麸皮36.0 g，K

39、2HPO4 0.2 g，MgSO47H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，琼脂 1520 g，定容至1L，pH 7。（2）可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.27.5。2. 制备斜面孢子：将保藏的菌种接种于液体培养基中（不加琼脂的斜面培养基），28下200 r/min振荡培养，将活化1d后的金霉素链霉菌种接入斜面培养基，28培养57天，待孢子长成灰色，于4冰箱中保藏。3. 种子培养：将在斜面上生长良好的菌体用接种铲挑取1cm2左右接入装有50ml四环素种子培

40、养基的250ml锥形瓶中， 230 r/min、28下振荡培养2024h。4. 发酵培养：以剪口移液枪头取10 ml种子液接入装有100ml发酵培养液的500ml锥形瓶中，230 r/min、28下振荡培养5 d。用于后面的测定效价和薄层层析实验。实验十 四环素、金霉素的薄层层析鉴定一、实验目的掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法二、实验原理层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料

41、混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差

42、异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等三种类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动

43、相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析

44、后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。三、实验仪器和设备 玻璃层析缸、层析板 、毛细玻璃管或微量注射器、紫外投射仪、四环素、金霉素标准品、正丁醇、醋酸、凡士林四、实验步骤1层析板处理 层析板105烘烤过夜，均匀喷上0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH4.5)，于空气中晾干、备用。2点样选取两种定向发酵液约1ml于1.5ml离心管中，10000 rpm，5min，备用。在距层析板底边2.53 cm起始线上(用铅笔划线，做出点样点记号)，用毛细玻璃管在薄层层析板上点四环素标准品和金霉素标准品溶液3次，发酵液上清点810次，

45、点样点不大于0.4cm，每次都要吹干后再点。（一般效价在1000uml以上点3次，5001000uml点4次，200500uml点5次）。3. 层析（展开）用正丁醇：醋酸：水(415)的上相作展开剂。层析前需预先用展开剂预平衡层析缸，可在缸中倒入2cm高的展开剂，密闭，一般保持1530分钟。然后将层析板置于盛有展开剂的层析缸中，在室温下展层68h（与温度有关）。封口不严可涂抹凡士林。4荧光显影待溶剂前沿展至板的一半以上时将层析板取出，标出溶剂前沿，于通风橱中晾干，用氨水熏数秒钟后即可在紫外灯下显影，画出黄色斑点，分别算出Rf值。（四环素标准品慢和金霉素标准品快）无水四环素在波长365nm下显黄

46、色荧光，根据与标准对照可定性测定。五、注意事项1. 要控制好点样量，样品太少，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大或拖尾现象。2. 若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。3. 点样时必须注意勿损伤薄层表面。4. 作展开剂中极少量强极性溶剂(0.5)或pH值的改变可显著改善拖尾现象。实验十一 四环素效价测定一、实验目的：1. 了解抗生素效价的表示方法2. 学习抗生素的测定方法二、实验原理：实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。效价(titer或titre)是评价抗生素效能的标准，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，也是衡量发酵液中抗生素含量的尺度，人们以1g金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6g青霉素G钠盐为1个单位。四环素和金霉素在酸性条件下，加热，可产生黄色的脱水金霉素和脱水四环素，其色度与含量成正比。在碱性条件下，四环素较稳定，而金霉素则生成无色的异金霉素： 根据上述原理，可以在酸性条件下，利用比色法测定四环素、金霉素混合液的总效价；而四环素效价的测定可在碱性条件下，使金霉素生成无色的异金霉素，