猪肠型大肠杆菌病的诊断方法.docx

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1、猪肠型大肠杆菌病的诊断方法1、诊断办法新生仔猪和断奶仔猪肠型大肠杆菌病的诊断包含不同诊断程 序的联合应用，从观看临床症状和眼观病变开头，随后举行适当的细 菌学调查以及对分别的细菌菌株定性。1.1 临床症状、眼观病变和采样因为肠毒性大肠杆菌造成的新生仔猪腹泻最常见于04日龄 的仔猪，通常呈地方性流行；头胎母猪所产仔猪可能更简单感染，由 于它们缺少被动免疫的庇护(所以头胎母猪普通建议产前举行两次疫 苗免疫)。由大肠杆菌造成的断奶仔猪骤然腹泻，通常见于断奶后2周 3周的仔猪，但是见于断奶后6周8周的仔猪也并非特例。当肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli, ETEC)造成新生仔

2、猪 腹泻时，我们能够观看到发病仔猪会浮现大量水样或含有凝乳块的腹 泻，散发出特点性气味，色彩通常呈白色或黄色。由ETEC启发的断奶仔猪大肠杆菌病通常以淡黄色、灰色或淡粉色水样腹泻和特点性气味为主，病情通常持续1周。感染猪通常表现为精神沉郁、食欲减退和被毛粗乱黏湿。发病 猪可能会浮现骤然死亡，尤其是在疾病暴发伊始。死猪通常脱水，且 眼窝深陷；小肠通常扩张、轻度水肿和充血。新生仔猪或断奶仔猪发 生大肠杆菌病后，胃通常膨胀，且分离弥漫凝乳块或干饲料，基底部 充血（图3）o肠系膜淋巴结肿大，且通常充血。这些病变虽然不具有 特异性病征，但仍提醒肠型大肠杆菌病。因此，对患有大肠杆菌病的 新生仔猪和断奶仔猪

3、举行剖检，可协助病理学者挑选后续的试验室检 查办法。最有效的办法是挑选腹泻、发病时光不足12h24h的一定数 量（3头5头）的未（治疗）病猪，处以安乐死并举行精准剖检，从而 评价眼观病变（评价小肠、结肠、回肠瓣膜、肠系膜淋巴结）并采样。 采集未剖开且两端系扎的小肠（尤其是回肠和空肠）和大肠样本，并送 至试验室（新奇样本用于细菌学检验，10%福尔马林缓冲液固定的样 本用于组织学检查），细菌学检验要求分别启发疫病的致病性大肠杆 菌菌株，定量（举行或不举行纯化培养）、定性和评估对抗生素的敏感 性。新奇样本应该在4回下储存，且应在采样后24 h内送达试验室保 存。近期自发死亡的仔猪也能够用于微生物学分

4、析。因为机体死亡 后消化道会快速自体分解，因此从死亡后4 h6 h的仔猪上采集的组 织样本通常不适合举行组织病理学分析。假如安乐死或近期死亡的猪 未表现出肠型大肠杆菌病的典型临床症状，建议对3头5头猪采集 粪便样本（直接从动物体内采集，而不是采集排泄在地板上的粪便）或 直肠拭子。对多种检查结果汇总后方能确诊，包括：细菌学定量测定、致 病因子鉴定（通常采纳PCR办法），以及将病理学检查作为补充分析, 从而对观看到的显微病变与检测到的病原举行综合的判读。列出了在 诊断肠型大肠杆菌病时应该遵从的诊断树状图和诊断标准。1.2 细菌分别株的细菌学检测和鉴定肠型大肠杆菌病的诊断是以肠道管腔内容物（首选）或

5、直肠拭子 样本的细菌学检测为基础的。样本应接种于血琼脂和麦康凯琼脂或者 其他对肠杆菌科细菌具有挑选性的培养基，如HE琼脂。这些挑选性 培养基能够将可以发酵乳糖（如大肠杆菌）的与不能发酵乳糖的革兰氏 阴性肠杆菌区别开。固体培养基上的菌落在培养Id内达到它们原有 些大小，有光洁型或粗糙型或黏液型的区分。血琼脂上菌落的生长特 点以及在挑选性培养基上的乳糖发酵可以给出第一个判别性标志。特 殊是，不仅在新生仔猪腹泻上而且在断奶仔猪腹泻中，溶血菌落的存 在通常被用作ETEC腹泻的迅速诊断工具。总的来说，从新生仔猪大 肠杆菌病病例中分别的ETEC在血琼脂平板上可能会浮现溶血(ETEC F4阳性)或非溶血(E

6、TEC F5、ETEC F6和ETEC F41)菌落。从断奶仔猪腹 泻病例中分别的ETEC虽然也可观看到非溶血菌株，但大多数为溶血 菌株(ETECF4或ETECF18)。在最近的一项讨论中，讨论人员报告称从 鉴定为ETEC的断奶仔猪腹泻病例中分别到的大肠杆菌菌株有97.6% 为溶血菌株。剩余的2.4%非溶血ETEC分别株在法国、意大利和德国 分别到，拥有相同的致病型别：F4、STa和STb,这些分别株所有举 行了溶血活性检测。检出致病菌株并不说明该病存在于每个病例中，固然，正如上 述报道中的那样，致病性大肠杆菌也可能从健康宿主的肠道栖居环境 中分别到。因此，对诊断结果的评估，惟独在同时考虑了临

7、床症状和病理 学观看结果这两种状况后，再结合分别到的致病性大肠杆菌的定量分 析结果才干给出。因此，分别自小肠(回肠和空肠)的纯培养物或临近 纯培养物中高浓度的致病性大肠杆菌是肠型大肠杆菌病的标志。因为 几乎全部的ETEC F4或ETEC F18都是溶血的，浮现溶血菌落纯培养物 能够作为新生仔猪大肠杆菌病(ETEC F4)或断奶仔猪大肠杆菌病(ETECF4或ETEC F18）的假定性诊断依据。对用抗生素（治疗）的动物其细菌学检测阴性结果的判读不行 靠，因此需要对未（治疗）猪举行重新检查。鉴定分别株编码菌毛和毒素的毒力基因，对于确定其在所观看 到的临床症状中的作用至关重要。当前，在诊断程序中，许多

8、试验室 用基因型分析检测编码毒力因子的基因，从而对该分别株定性。市场 上己经提供可识别ETEC编码毒素（STa、STb、LT和EAST1）和菌毛（F4、 F5 F6、F18 和 F41）、肠道致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E.coli, EPEC）外膜蛋白族或黏附素、产志贺毒素大肠杆菌STEC（与水肿病有关 的大肠杆菌）菌株Stx2e毒素的基因引物，并可用于PCR以举行平时诊 断。好玩的是，某些F18菌株既能产生肠毒素又可产生Stx2e毒素。 这些菌株被归为ETEC而非STEC,由于它们在临床上启发的断奶仔猪 腹泻远多于水肿病。应用尽头PCR直接鉴定病猪样本中毒力因子，而不

9、是对各个分 别株举行半定量细菌学检测和分型，可能会使判读变得困难且不行靠。 这种诊断办法并不能对病原举行定量，能够给出属于浮现在样本中的 各种大肠杆菌菌株的全部可检测毒力因子的混合结果，结果无法将这 些因子组合起来。此外，不能排解检测到其他肠杆菌科细菌的相像毒 力因子基因。例如，对分别自墨西哥儿童腹泻病例的细菌菌株举行的 讨论表明，一株被鉴定为M. morganii菌株的ST毒素基因与大肠杆菌 的一个ST毒素基因100%相同。讨论人员从前报道的可编码LT毒素 的基因属于从腹泻游客粪便样本中分别的M. morganii菌株。定量PCR(Quantitative PCR, qPCR)的进展已经成为

10、一项能够单 独举行或与细菌学检测一起举行的切实可行的诊断办法。St hl和其同 事报道，当与培养来自腹泻猪粪便样本中的大肠杆菌F4和E18办法 相比较时，此qPCR办法具有更高的敏捷性。细菌培养法未能检测到 致病性大肠杆菌，而采纳此办法后，34%的样本呈F4-qPCR和/或 F18-qPCR阳性。当检测到的大肠杆菌F4和/或大肠杆菌F18含量高于 107CFU/g时，表明培养了大量的条件致病性大肠杆菌。虽然用qPCR 对致病性大肠杆菌举行定量检测是一种诊断肠型大肠杆菌病的有应 用前景的办法，但是半定量细菌学检测办法对于启发大肠杆菌病的大 肠杆菌菌株的分别和抗菌药敏感性试验仍具有至关重要的作用。

11、通常，F4阳性大肠杆菌的暴发，在任何时候往往惟独一种菌 株参加，哪怕我们在同一次暴发中观看到了混合感染且分别到了不同 的致病型别菌株。在这些病例中，一种致病型别菌株很可能在任何暴 发中占领着主导作用。因此，最合适的做法是，在定量细菌学检测之 后且与检测成本相称的状况下，对从发病猪群中不同猪上分别到的更 多分别株举行分型，从而确定某一次暴发的肠型大肠杆菌病病例是否 涉及一种以上的致病型别。例如，明智的做法是检测来自5头典型腹 泻猪的样本，并对按照培养和生化特性挑选的3个分别株举行定型。 虽然，这种办法不会给出确切的结果，但是其确实会提升所获结果的 可信度。在断奶仔猪腹泻暴发期间，讨论人员根据上述

12、报道的采样办法 对欧洲160个猪群举行了一项讨论，结果讨论人员在该次暴发中观看 到了 13%的患病猪有混合感染（ETEC F4和ETECF18乂数据未藏匿发表）。致病性大肠杆菌也能够利用0抗原（细胞壁LPS）的血清分型举 行鉴定，由于少数特异性。血清群可以启发该病。H抗原（鞭毛蛋白抗原）和O抗原的全部血清分型，以及除此之 外K抗原（荚膜多糖）的鉴定，是全部血清型标准的鉴定办法，但是通 常在少数参考试验室中举行。一个血清群中不同的菌落可能已经进化，产生了不同致病基因, 造成与特定地区或国家有关的克隆变异。例如，与全球范围内菌毛 F18 ab相关的ETEC 0139血清群，通常会在澳大利亚启发断奶

13、仔猪腹 泻，在欧洲启发猪的OD,而与世界范围内猪中的断奶仔猪腹泻相关 的优势血清群是0149。2、组织病理学对福尔马林固定、石蜡包埋的组织(应当包括回肠、空肠和大 肠)举行组织病理学检测能够用作大肠杆菌病确诊的一种补充性调查 法。在发生新生仔猪大肠杆菌病的仔猪体内，我们能够观看到F4阳 性肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli, ETEC)附着于空肠和回肠的 大部分肠黏膜上皮细胞刷状缘膜上，而其他ETEC主要附着于空肠远 端或回肠。其他变化包括血管充血、出血和炎性细胞(肠道固有层中 的中性粒细胞和巨噬细胞)数量增多。ETEC型断奶仔猪腹泻 (Post-weaning Di

14、arrhoea, PWD)的显微病变以在回肠和很少向来在空 肠段顶层绒毛上皮细胞的斑点(patch)上观看到的细菌层为特点。在肠 道固有层浅表部位可观看到绒毛轻度萎缩和中性粒细胞数量增多。免 疫组织化学法和原位杂交荧光法能够用作确诊观看到的显微病变的 病原学办法。3、鉴别诊断猪暴发的肠道病通常是由多因子引起的。注意诊断和随后的控 制措施而不考虑全部可能的鉴别诊断或涉及的多种因素可能会误导 执业兽医师的推断。新生仔猪和断奶仔猪大肠杆菌病的诊断评价要求 采纳相像的标准诊断程序。假如剖检时观看到的病变十分具有指向性, 那么诊断路径很简单落实，这适用于肠型大肠杆菌病。按照记录到的 病理损伤，细菌学检测

15、通常能够对获得的初步结论轻易确诊。仔猪断 奶前的腹泻比断奶后的腹泻更易直接地鉴定、（治疗）和预防。尤其 是ETEC造成的新生仔猪腹泻必需与启发腹泻的其他病原相区分，如 艰巨梭菌、A型和C型产气荚膜梭状芽泡杆菌、肠内冠状病毒和轮状 病毒（A群、B群和C群）。对于年龄大于7日龄的仔猪，它们的鉴别 诊断还应当考虑由猪等抱子球虫造成的球虫病。ETEC造成的断奶仔猪腹泻应与已经在仔猪中确诊过的其他腹 泻的病因相区分,如肠道致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E.coli, EPEC）、肠内冠状病毒（TGEV、PEDV）、轮状病毒（A群、B群和C群）、 沙门氏菌、启发增生性肠炎的胞内劳森菌和短螺旋体属。