L_精氨酸对病理性心肌肥大抑制作用的研究_沈云虹[1].docx

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1、L-精氨酸对病理性心肌肥大抑制作用的研究 沈云虹 1 肖 薇 2金莉 2 张相国 2 林岩 2 1.齐齐哈尔医学院机能实验室，黑龙江齐齐哈尔 161006; 2.齐齐哈尔医学院病理生理学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006 摘要 目的观察 L-精氨酸对心肌肥厚的保护作用及相关机制。方法雄性 Wistar 大鼠 36 只，随机分为 3 组，每 组各 12 只：对照组、模型组 (ISO 组 ）、 L-精氨酸治疗组。皮下注射异丙肾上腺素 （ ISO)复制大鼠心肌肥厚模型，检 测心脏重量参数（心重 /体重，左室重 /体重），心肌组织胶原含量，心房利钠肽 （ ANP)的转录水平，观察 i-精氨酸对 心肌

2、肥大的影响；检测各组大鼠血清一氧化氮 （ NO)、一氧化氮合酶 （ N0S)、 丙二醛 （ MDA)和乳酸脱氢酶 （ LDH)含 量。结果 L-精氨酸治疗组心重 /体重 (3.520.21)mg/g和左室重 /体重 (2.390.23)mg/g均低于 ISO组 心重 /体重 (3.890.25)mg/g,左室重 /体重 （ 2.670.26)mg/g)，差异有统计学意义 （ P0.05)。 同时， i-精氨酸治疗组 ANP mRNA 表达相对值 （ 1.2)低于 ISO 组 （ 1.5),差异有统计学意义 (P 0.05);心肌间质胶原含量， L-精氨酸治疗组 (14.523.09)%低于 I

3、SO 组 (35.244.78)%，差异有高度统计学意义（尸 0.01);i-精氨酸治疗组 NO 含量 (34.156.12)|xm l/L和 N0S 活性 (23.93.12)U/mL与 ISO 组 NO 含量 (20.965.06)|xm l/L和 N0S 活性 (16.58 土 3.12)11/11比较均增加，差异有高度统计学意义（ /30.01)4-精氨酸治疗组 1 水平 (308.7337.48)11111 1/1和 LDH 水平(2065.35347.46)U/L与 ISO 组 MDA 含量 (389.6342.85)nm l/L和 LDH 水平 (3582.89364.51)U/

4、L) 比较均降低，差异有统计学意义 (P 0.05 或 P 0.01)。 结 论 早 期 给 予 精 氨 酸 可 以 通 过 增 加 NO 含量，减少 MDA 和 LDH 水平，减少心肌间质胶原沉积进而抑制病理性心肌肥大 .。 关键词 心肌肥厚 ;精氨酸；一氧化氮 中图分类号 R364.31 文献标识码 A 文章编号 1673-7210(2014)05(a)-0015-04 Research of inhibitory effects of L-arginine on pathological cardiac hypertrophy SHEN Y unhong1 XIAO Wei2 JIN L

5、i2 ZHANG Xiangguo2 LINY an2 1.Functional Laboratory, Qiqihar Medical University, Heilongjiang Province, Qiqihar 161006, China; 2.Department of Pathophysiology, Qiqihar Medical University, Heilongjiang Province, Qiqihar 161006, China Abstract Objective To explore the role and the related mechanisms o

6、f L-arginine on pathological cardiac hypertrophy. Methods Male adult Wistar rats were randomized to three groups , control group (12 rats), ISO group (12 rats) and L- arginine group (12 rats). Hypertrophic model of rats was established by isoproterenol (ISO). Pretreated with L-arginine, hypertrophy

7、status of rats were determined by hypertrophy coefficient, collagen content and the expression of ANP mRNA. The activity and level of nitric oxide (NO), nitric oxide synthase (NOS), malonic dialdehyde (MDA) and lactate dehydrogenase (LDH) in serum were observed. Results L-arginine decreased the para

8、meter of ventricular mass, heart weight/body weight (3.520.21) mg/g and left ventricular weight/body weight (2.390.23) mg/g in L-arginine group were lower than those in ISO group heart weight/body weight (3.890.25) mg/g, left ventricular weight/body weight (2.670.26) mg/g, the differences were stati

9、stically significant (P 0.05). Meanwhile, the relative ratio of the ANP mRNA expression in L arginine group (1.2) was lower than that in ISO group (1.5), the difference was statistically significant (P 0.05); the myocardial interstitial collagen content of L arginine group (14.523.09)% was lower tha

10、t of than ISO group (35.244.78)%, the difference was statistically significant (P 0.01); the NO content (34.156.12) |xmol/L and NOS activity (23.93.12) U/mL of L-arginine increased than those of ISO group (NO content (20.965.06) |xmol/L, NOS activity (16.583.12)U/mL, the differences were statistical

11、ly significant (P 0.01)， at the same time, the MDA content (308.7337.48) nmol/L and LDH level (2065.35347.46) U/L of L-arginine group were decreased than those of ISO group MDA content (389.6342.85) nmol/L, LDH level (3582.89364.51) U/L, the differences were statistically significant (P 0.05 or P 0.

12、01). Conclusion Exogenous L-arginine can inhibit cardiac hypertrophy through increasing _ NO and NOS level, decreasing the level of MDA and 基金项目 黑龙江省教育厅科学技术研宄项目（编 1252 LDH, and decreasing myocardial interstitial collagen 1617)。 content. 通讯作者 林岩 （ 1975-)， 女，博士，教授；研宄方向：心血管 Key words Cardiac hypertroph

13、y; -arginine; Nitric 疾病发病机制。oxide CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11 No. 13 May 2014 15 TATCTTEGGTACCG-3Z;产物长度 458 bPsi PCR 产物 经2%琼脂糖凝胶电泳分离，并应用凝胶成像系统分 析，以目的片段 ANP 带的灰度与内参照 p-actin 带的 灰度之比表示ANP mRNA 的表达水平。 1.7 统计学方法 采用统计软件 SPSS 13.0 对数据进行分析，正态 分布计量资料以均数 标准差 s)表示，组间比较采 用 t检验；重复测量的计量资料多组间比较采用方差 分析，两两比较采用 LSD

14、-t 检 验 。 以 为 差 异 有统计学意义。 2 结果 2.1 心脏重量参数的变化 大鼠心肌重量参数即心重（左室重）与体重的比 值可作为评价大鼠心肌肥大的指标。 ISO 组与对照组 比较 ,ISO诱导大鼠心肌重量参数增加显著，心重 /体 重比值为（ 3.890.25) mg/g,左室重 /体重比值为 （ 2.67 0.26) mg/g,均明显高于对照组 心重 /体重比值 （ 3.39 0.25) mg/g,左室重 /体重比值 （ 2.330.11 )mg/g,差异有 统计学意义 (P 0.01 或 P 0.05)。见图 1。 L-精氨酸治疗组与 ISO 组比较 ,1-精氨酸可抑 制心肌重

15、量 参 数 ， I- 精 氨 酸 治 疗 后 ， 心 重 / 体 重 比 值 (3.520.21)mg/g 和左室重 /体重比值 （ 2.39 0.23)mg/g 均低于 ISO 组 （ P 0.05)。 2.2 心肌组织 ANP mRNA 表达水平的变化 ISO 组与对照组比较， ISO 组心肌组织 ANP 基因 的表达水平相对值 （ 1.5)明显高于对照组（ 1.0)，差异 有高度统计学意义 （ P0.01);i-精氨酸治疗组与 ISO 组比较，I-精氨酸治疗组 ANP 基因表达水平相 对值 （ 1.2)低于 ISO组，差异有统计学意义 (P 0.05)。 见图 2。 心肌肥大是高血压常见

16、的并发症，心力衰竭发生 的结构基础，也是心律失常等多种心血管疾病的独立 危险因素 。一 氧化氮 （ NO)是多种细胞均可以产生的 自由基，在全身各处广泛存在。作为 NO 的前体 I-精 氨酸可通过拮抗氧自由基、增加心肌组织能量代谢、 增加冠脉血流量和抑制中性粒细胞聚集等对心血管 系统发挥保护作用1。本研宄的主要目的是研宄 L-精 氨酸 -T 预对心肌肥大和细胞损伤的影响，及 NO 和一 氧化氮合酶 （ N0S)的变化，以探讨 I-精氨酸对心肌 肥大的作用机制。 1 材料与方法 1.1 动物 雄性 Wistar 大鼠 36 只，体重 （ 20020)g,齐齐哈 尔医学院动物中心提供。平衡饮食一周

17、后，将大鼠随 机分3 组，每组各 12 只： 对照组：给予 0.9%氯化 钠注射液 5mL/(kg_d)皮下注射； 模型组 （ ISO 组 ）： IS0皮下注射 5 mL/(kg*d)， 连 续 7 d; L-精氨 酸治疗组 ：IS0 皮下注射 5 mL/(kg_d)的同时给予 I- 精氨酸 800 mg/(kg_d)， 腹腔注射，常规给水，连续给 药 7 cF 1.2 试剂与设备 L-精氨酸，异丙肾上腺素 （ ISO)购于美国 Sigma 公司， Trizol 和逆转录试剂盒购于 Takala 公司 ， Leica 切片机 ， Leica 显微镜，电子天平；紫外 -可见分光光度 计（岛津 ）

18、， 乳酸脱氢酶 （ LDH)、 丙二醛 （ MDA)、 N0 和 N0S检测试剂盒购于南京建成生物公司。 1.3 样本采集 末次给药后次日，称量大鼠体重 （ BW)后， 2%乌 拉坦腹腔注射麻醉后，取心脏组织，称全心重 （ HW)和 左室重 （ LVW),立即投入液氮中保存。 1.4 肢原纤维染色 取心肌组织左室游离壁， 10%甲醛固定，石蜡包 里，常规 HE 和胶原纤维染色 (VG)。 图像分析系统分 析心肌间质胶原含量。 1.5 生化指标检测 剥离左侧颈总动脉，取血。 4T； ， 3000 r/min 离心后 取上清。用 N0、 N0S、 MDA 和 LDH 试剂盒测定血清 中相应酶的活性

19、或含量。步骤完全按照试剂盒说明操 作。 1.6 RT-PCR 反应检测大鼠心肌组织 ANP 基因表达 RT-PCR 按 TRIzol 试剂盒说明书抽提心肌组织 总RNA,紫外测定 OZ)26 /OZ)28 的比值。参照 Takala 公 司说明书将 RNA 逆转录成 cDNA， 以合成好的 cDNA 为模板进行 PCR 扩 增 反 应 。 ANP 上游引物 ： 5 二 GGCTCCTTCTECATGACCAA-3、 下游引物 ： 5-TGT- 16 CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11 No. 13 May 2014 注：与对照组比较 /P 0.05/7 0.01;与 IS

20、O 组比较， 0.05,WP 0.01 图 5 L-精氨酸对血清丙二醛含量和乳酸脱氢酶活性的影响 3 讨论 心肌肥大既是压力负荷增加时心肌组织代偿性 CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11 No. 13 May 2014 17 注 :与对照组比较 /P 0.05/P 0.01;与组虽 ISO 组比较 ， #P 0.05 0.05 ;N0: 氧化氮； NOS: 氧化氮合酶 图 4 L-精氨酸对血清 NO 含量和 NOS 活性的影响 注 :A:ANP 基因表达电泳图； B:各组 ANP 基因水平相对值图；与对 照 组 比 较 0.01;与 ISO 组比较 ， #P 0.05 图

21、2 ANP 基因表达电泳与各组 ANP 基因水平相对值 2.3 心组织胶原含量的变化 心肌组织经 Van Gieson 染色后，光镜下见心肌细 胞呈橘黄色，间质胶原纤维呈红色。病理图像分析系 统分析显示， ISO 组与对照组比较， ISO 组心肌组织间 质胶原含量 (35.244.78)% 明 显 高 于 对 照 组 (7.02 土 2.13)%，差异有高度统计学意义 P 0.01) ;L-精氨 酸治疗组与 ISO 组比较，胶原含量 (14.523.09)%低 于ISO 组，差异有高度统计学意义 (P 0.01)。见图 3。 2.4L-精氨酸干预对心肌组织 NO、 NOS、 MDA 和 LDH

22、 水平的影 响 ISO 组 NO 含量 (20.965.06)|jLmol/L和 N0S 活性 (16.583.12)U/mL 与对照组 NO 含量 （ 36.72 5.32)|jLmol/L， NOS 活性 （ 24.963.59)U/mL比较，明显 降低，差异有高度统计学意义 CP 0.01)。见图 4。 ISO 组 MDA 含量 (389.6342.85)nmol/L和 LDH 水平 (3582.89364.51)U/L 与对照组 MDA 含量 (240.7226.63)nm /L,LDH 水平 （ 1328.62206.35)U/L 比较显著增加，差异有统计学意义 （ P 0.05 或

23、 P 0.01)。与 ISO 组比较， i- 精氨酸治疗组 NO 含量 (34.156.12)fjLmol/L和 N0S 水平 (23.993.12)U/mL 均增力口，差异有统计学意义 (P 0.01 或 0.05 ),MDA 水平 (308.7337.48)nmol/L 和 LDH 水平 (2065.35 士 347.46)U/L均降低，差异有统计学意义 （ P 0.05 或 P 0.01)。见图 5。 增生的结果，又是高血压、心律失常、心力衰竭等心血 管疾病的独立危险因素。严重影响患者的预后，并增 加死亡率 4。因此，探讨心肌肥大的发病机制，寻找有 效的防治措施， 具有重要的临床意义。

24、ISO 通过激活 p-肾上腺素受体诱导的心肌肥 大，被认为是研宄心肌肥厚的重要模型 5。 ISO 皮下 注射 7 d 后，心脏重量参数明显增加， ANP 基因表 达增高，同时心肌间质胶原增加，这些均表明心肌 肥大模型复制成功。 LDH 是催化 I-乳酸与丙酮酸 之间可逆反应的脱氢酶。广泛存在于心肌、肝、骨骼 肌、肺等各种组织中。当心肌细胞受到损伤时 ， LDH 等心肌酶从胞浆中漏出，测定血清和组织中 LDH 活性可反映心肌损伤程度，并已成为反映心肌损伤 程度的敏感指标被广泛采用。 MDA 对心肌的毒性损 伤主要与氧 自由基损伤、钙超载、细胞凋亡、 ADM 继 发代谢产物等有关。二者联合可反映心

25、肌组织损伤 程度。实验结果显示， ISO 诱导心肌肥大的同时，增 强了血清中 LDH 活性和 MDA含量，表明 ISO 诱导 心肌肥大的同时，引发心肌组织强烈的脂质过氧化 反应，产生大量的自由基，严重损伤心肌组织。 近年， I-精氨酸对心肌疾病的作用研宄开展较 多，有助于进一步解释心肌疾病的机制，寻找新的治 疗靶点。 I-精氨酸在 N0S 的作用下，生成 NO 和 I-瓜 氨酸，即 L-精氨酸一 NO 通路。目前认为 I-精氨酸一 NO 通路所产生的 NO 主要通过自分泌和（或）旁分泌 的方式发挥其生理效应。目前研宄表明， NO 供体具有 减轻缺血再灌注引起的心肌细胞损伤和减轻腹主动 脉缩窄大

26、 鼠 心 肌 肥 厚 的 作 用 本 研 宄 结 果 表 明 ， L- 精氨酸干预后明显降低心脏重量参数和 ANP 基因表 达水平，同时又减少心肌间质胶原含量，对心肌肥大 有明显的抑制作用。同时发现，心肌肥大时， N0S 活性 和 NO含量均降低 ,1-精氨酸 -T 预后，显著逆转了上述 改变。在生理情况下，心肌中可以表达内皮型 氧化 氮合酶（ eNOS)和神经元型一氧化氮合酶 （ nNOS)， 二 者以精氨酸为底物生成 N0,参与心 肌收缩的调整。不 同亚型的 N0S 在心肌中的位置不同，从而对心肌的 收缩产生不同的影响 8- Ganzinelli 等 w研宄表明 NO 弥散进入细胞核后，影

27、响 c-fos， c-myc 相关基因转录 水平，进而抑制心肌肥大。与对照组比较， ISO 增强了 LDH 活性和 MDA 含量。 i-Arg 显 著 降 低 MDA 含量 和 LDH 活性。推测 L-精氨酸通过促进 NO 的产生，减 少过氧亚硝酸阴离子 （ 0N00-)生成，直接中和氧自由 基，消除氧自由基对心肌的损害，并增强膜稳定，从而 减轻细胞损伤。 综上所述， L-精氨酸千预，通过激活 i-精氨酸一 NO 通路，促进体内 NO 浓度增加，可减轻心肌肥大和 保护心肌细胞。随着今后的深入研宄，将为 I-精氨酸 的临床应用提供广阔前景。 参考文献 m 王天辉，刘洪涛，佘晓俊，等丄 _精氨酸对

28、大鼠心肌相对 缺血 /再灌注损伤保护作用的研究 j.中国应用生理学 杂志，2005,21 (3) :266-269. 2 Stanton HC,Brenner G,Mayfield ED. Studies on isoproterenol induced cardiomegaly in rats J. Am Heart J, 1969,77 (1)： 72-80. 3 林岩，徐长庆，赵雅君，等 .多胺在异丙肾上腺素所致大 鼠心肌肥厚中的作用及意义 J.中国病理生理杂志， 2009, 25(3)：417-421. 4 Dirkx E,da Costa Martins PA,De Windt LJ

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31、le mice J. Life Sci,2013,12(3) ： 24- 27. 8 Jeong MY,WalkerJS,Brown RD,et al. AFos inhibits phenylephrine-mediated contractile dysfunction by altering phos- pholamban phosphorylation ). Am J Physiol Heart Circ Physiol ,2010,298(6) ： 1719-1726. 9 Hunter JC,Zeidan A,Javadov S,et al. Nitric oxide inhibi

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