实验十微生物的生理生化反应.ppt

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1、实验九、十微生物的生理生化反应微生物的生理生化反应一、目的要求一、目的要求n1.了解细菌的一般生化反应；n2.了解细菌的生化鉴定方法其原理。二、实验材料二、实验材料菌种：大肠杆菌；枯草杆菌；变形杆菌；自己分离的大肠杆菌。菌种：大肠杆菌；枯草杆菌；变形杆菌；自己分离的大肠杆菌。培养基：糖发酵培养基（葡萄糖）培养基：糖发酵培养基（葡萄糖）(紫色液体内带指管）；紫色液体内带指管）；H2S试验用培养基（黄色固体）；试验用培养基（黄色固体）；蛋白胨水培养基（黄色液体，吲哚试验用）；蛋白胨水培养基（黄色液体，吲哚试验用）；淀粉培养基（黄色固体需融化倒平板）；淀粉培养基（黄色固体需融化倒平板）；葡萄糖蛋白胨

2、水培养基（黄色液体，甲基红，葡萄糖蛋白胨水培养基（黄色液体，甲基红，VP试验试验用）用）*。试剂：吲哚试剂；碘液；甲基红试剂；试剂：吲哚试剂；碘液；甲基红试剂；VP试剂。试剂。三、实验原理及方法三、实验原理及方法由于各种微生物的新陈代谢类型不同，因此，对各种物质由于各种微生物的新陈代谢类型不同，因此，对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同，我们可以用化学反应来测定利用后所产生的代谢产物也不同，我们可以用化学反应来测定微生物的代谢产物，这种反应称为生化反应。微生物的代谢产物，这种反应称为生化反应。生化反应常用来鉴别在形态或其它方面不易区别的微生生化反应常用来鉴别在形态或其它方面不易区别的微生物，

3、例如：肠道细菌中，大肠杆菌和伤寒杆菌，二者在形态上物，例如：肠道细菌中，大肠杆菌和伤寒杆菌，二者在形态上不易区分，但前者能发酵乳糖，后者不能。因此可以从它们能不易区分，但前者能发酵乳糖，后者不能。因此可以从它们能否发酵乳糖来区别它们，所以微生物的生化反应是微生物分类否发酵乳糖来区别它们，所以微生物的生化反应是微生物分类鉴定的重要依据之一。鉴定的重要依据之一。1.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的生化反应，在糖发酵试验是常用的生化反应，在肠道细菌肠道细菌的鉴定上尤的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为能源及碳源，但是细为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为能源及碳源，但是细菌的分解糖类的能力上

4、有相当大的差异，某些菌能使某些单糖菌的分解糖类的能力上有相当大的差异，某些菌能使某些单糖或双糖分解，并产酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（甲烷、或双糖分解，并产酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（甲烷、氢、二氧化碳），或者只产酸而不产生气体。酸和气体的产生氢、二氧化碳），或者只产酸而不产生气体。酸和气体的产生与否，可以由培养后试管指示剂的颜色变化和小套管内气泡的与否，可以由培养后试管指示剂的颜色变化和小套管内气泡的有无来判定。当发酵产酸时，指示剂溴甲酚紫由紫色有无来判定。当发酵产酸时，指示剂溴甲酚紫由紫色（pH6.8）变为黄色（变为黄色（pH5.2）。）。其步骤如下：其步骤如下：（1）取盛有葡萄糖发

5、酵培养基的试管四支（内装有）取盛有葡萄糖发酵培养基的试管四支（内装有小套管），一支接种大肠杆菌，第二支接自己分离的小套管），一支接种大肠杆菌，第二支接自己分离的大肠杆菌，第三支接枯草杆菌，第四支不接种，作空大肠杆菌，第三支接枯草杆菌，第四支不接种，作空白对照。在各试管上标明菌名和组别，置白对照。在各试管上标明菌名和组别，置37培养培养24小时观察。小时观察。大肠杆菌、自己分离的大肠杆菌、枯草杆菌、对照。大肠杆菌、自己分离的大肠杆菌、枯草杆菌、对照。（2）观察结果：经培养后，指示剂呈黄色者表示为）观察结果：经培养后，指示剂呈黄色者表示为阳性，同时观察小套管中有无气泡产生。阳性，同时观察小套管中有

6、无气泡产生。“+”“+”表示产酸；表示产酸；“”“”表示产酸产气；表示产酸产气；“-”“-”表示阴表示阴性。性。2吲哚试验 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚。吲哚与对二甲基氨苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚。吲哚与对二甲基氨苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，此为红色化合物，其反应变化如下：哚，此为红色化合物，其反应变化如下：（1 1）取蛋白胨水培养基试管四支，分别接种大肠杆菌，自己分）取蛋白胨水培养基试管四支，分别接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支作空白对照，并在试管上注离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支作空白对照，并在试管上注明菌名和组别，置明菌名和

7、组别，置3737培养培养2424小时。小时。（2 2）培养后取出，在培养液中先加入乙醚约）培养后取出，在培养液中先加入乙醚约1 1毫升（使呈明显毫升（使呈明显的乙醚层），充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，使乙的乙醚层），充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上面，这时再沿管壁慢慢加入吲哚试剂醚层浮于培养基的上面，这时再沿管壁慢慢加入吲哚试剂5 51010滴，观察有无红色出现。有红色环出现者为阳性，黄色者为阴滴，观察有无红色出现。有红色环出现者为阳性，黄色者为阴性。性。（注意：加入试剂后不可再摇动，否则被混合，红色不明显。）（注意：加入试剂后不可再摇动，否则被混合，红色不

8、明显。）大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。3产硫化氢试验 某些菌能分解含硫的有机物或无机物产生硫化氢（某些菌能分解含硫的有机物或无机物产生硫化氢（H H2 2S S），），H H2 2S S遇金属盐类，如铅盐、铁盐等，则形成黑色的硫化铅或硫化铁遇金属盐类，如铅盐、铁盐等，则形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物。从而可断定的沉淀物。从而可断定H H2 2S S的产生与否。的产生与否。其测定方法有两种：其测定方法有两种：一种是用含有柠檬酸铁铵的培养基穿刺培养，看是否有黑一种是用含有柠檬酸铁铵的培养基穿刺培养，看是否有黑色沉淀（本实验采用

9、）；色沉淀（本实验采用）；另一种是在盛有液体培养基的试管中接种菌以后，在试管另一种是在盛有液体培养基的试管中接种菌以后，在试管的棉塞下吊一片醋酸铅试纸，经培养后看醋酸铅试纸是否变黑。的棉塞下吊一片醋酸铅试纸，经培养后看醋酸铅试纸是否变黑。其步骤如下：其步骤如下：（1 1）取）取H H2 2S S试验用培养基四支（内含有柠檬酸铁铵），分别用试验用培养基四支（内含有柠檬酸铁铵），分别用穿刺法接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌和变形杆菌，留一穿刺法接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌和变形杆菌，留一支空白，试管上注明菌名和组别，置支空白，试管上注明菌名和组别，置3737培养培养2424小时。小时。大肠杆菌

10、，自己分离的大肠杆菌，变形杆菌，空白对照。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，变形杆菌，空白对照。（2 2）培养后取出观察，看有无黑色沉淀）培养后取出观察，看有无黑色沉淀产生。产生。4伏一普（Voges-proskauer）试验，即VP反应某些菌生长于葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡某些菌生长于葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，而丙酮酸又可缩合、脱羧而转化萄糖产生丙酮酸，而丙酮酸又可缩合、脱羧而转化成乙酰甲基甲醇，如加入强碱液，即与空气中的氧成乙酰甲基甲醇，如加入强碱液，即与空气中的氧起作用产生二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的含胍基成起作用产生二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的含胍基成分作用生成红色化合

11、物，称阳性反应，没有红色化分作用生成红色化合物，称阳性反应，没有红色化合物产生则称阴性反应。合物产生则称阴性反应。实验步骤：实验步骤：（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，分别接种大肠杆菌，自己）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，分别接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支作空白对照，并在试管上分离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支作空白对照，并在试管上注明菌名和组别。置注明菌名和组别。置3737培养培养2424小时。小时。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。（2 2）培养后取出，加入）培养后取出，加入5-105-10滴滴40%KO

12、H40%KOH及等量的及等量的VPVP试剂液，用试剂液，用 力振荡，放置力振荡，放置3737温室温室15-3015-30分钟，呈红色者为阳性，不呈分钟，呈红色者为阳性，不呈 红色者为阴性。红色者为阴性。5甲基红试验（MR试验）某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能产生大量的某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能产生大量的酸，使酸，使pHpH降低至降低至4 45 5，它先产生丙酮酸，丙酮酸再被，它先产生丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可由加入甲基分解成甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示（有效红指示剂的变色而指示（有效pHpH范围为范围为4.24.26.36.

13、3）。）。细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的桔黄色，细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的桔黄色，变为红色，即为甲基红反应。变为红色，即为甲基红反应。实验步骤：实验步骤：（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，一支接种大肠杆菌，第二一支接种大肠杆菌，第二支接自己分离的大肠杆菌，第三支接枯草杆菌，第四支不接支接自己分离的大肠杆菌，第三支接枯草杆菌，第四支不接种，作空白对照。在各试管上标明菌名和组别，置种，作空白对照。在各试管上标明菌名和组别，置37培养培养24小时。小时。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照

14、。（2 2）培养后取出，沿管壁加入甲基红指示剂）培养后取出，沿管壁加入甲基红指示剂3 34 4滴上层呈红色滴上层呈红色者为阳性。者为阳性。6淀粉水解试验 某些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶某些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。实验步骤：实验步骤：（1 1）淀粉培养基在水浴中融化后，冷至）淀粉培养基在水浴中融化后，冷至5050，以无菌操作，以无菌操作制成平板。用接种环取少量枯草杆菌在平板的一边划制成平板。用接种环取

15、少量枯草杆菌在平板的一边划“+”“+”字字形接种（或点种），另取少量大肠杆菌菌在平板的另一边形接种（或点种），另取少量大肠杆菌菌在平板的另一边接种，接种，在各培养皿底部标明菌名和组别在各培养皿底部标明菌名和组别。置。置3737温箱中培温箱中培养养16162020小时。小时。大肠杆菌，枯草杆菌。大肠杆菌，枯草杆菌。（2 2）观察结果：打开皿盖，滴加少量碘液于培养基）观察结果：打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，使碘液均匀铺满整个平板。如上，轻轻旋转培养皿，使碘液均匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解。透明果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解。透明圈大小说明

16、该菌水解淀粉能力的大小。圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。五、结果与思考题五、结果与思考题1 1将实验结果填于书将实验结果填于书P120P120表中表中试验结果：试验结果：“+”“+”表示阳性反应；表示阳性反应；“-”“-”表示阴性表示阴性反应。反应。2 2细菌的生化反应试验意义何在？细菌的生化反应试验意义何在？、糖发酵试验：糖发酵培养基，、糖发酵试验：糖发酵培养基，大肠杆菌、自己分离的大肠杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、自己分离的大肠杆菌、枯草杆菌、空白空白对照。对照。2、H2S试验：半固体培养基，试验：半固体培养基，大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，变形杆菌变形杆菌，空

17、白对照。，空白对照。3 3、吲哚试验：、吲哚试验：蛋白胨水培养基；蛋白胨水培养基；大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。4 4、淀粉水解试验：、淀粉水解试验：淀粉培养基到平板；淀粉培养基到平板；大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。5、VPVP反应：反应：葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基*。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。6 6、甲基红试验（、甲基红试验（MRMR试验）：试验）：葡萄糖蛋白胨水培养

18、基葡萄糖蛋白胨水培养基*。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，空白对照。.糖发酵试验：糖发酵试验：经培养后，指示剂呈黄色者表示为阳性，同时观察小套管中经培养后，指示剂呈黄色者表示为阳性，同时观察小套管中有无气泡产生。有无气泡产生。“+”“+”表示产酸；表示产酸；“”“”表示产酸产气；表示产酸产气；“-”“-”表示表示阴性。阴性。2.H2S试验：试验：培养后取出观察，看有无黑色沉淀产生培养后取出观察，看有无黑色沉淀产生.有有“+”“+”3.3.吲哚试验：吲哚试验：在培养液中先加入乙醚约在培养液中先加入乙醚约1 1毫升（使呈明显的乙醚层），充分

19、振毫升（使呈明显的乙醚层），充分振 荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上面，这时再沿荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上面，这时再沿 管壁慢慢加入吲哚试剂管壁慢慢加入吲哚试剂5 51010滴，观察有无红色出现。有红色环出现者为阳滴，观察有无红色出现。有红色环出现者为阳 性，黄色者为阴性。性，黄色者为阴性。4 4、淀粉水解试验：、淀粉水解试验：打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，使打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，使 碘液均匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解。碘液均匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解。透明圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。透明圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。5、甲基红试验（甲基红试验（MRMR试验）：试验）：沿管壁加入甲基红指示剂沿管壁加入甲基红指示剂3 34 4滴上层呈红色者为滴上层呈红色者为 阳性。阳性。