SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(1).ppt

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1、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 一一.实验目的实验目的学学习习SDS-PAGESDS-PAGE测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量的原理。的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。运运用用SDS-PAGESDS-PAGE测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量及染色鉴定。及染色鉴定。二二.实验原理实验原理带带电电质质点点在在电电场场中中向向带带有有异异相相电电荷荷的的电电极极移移动动，这这种种现现象称为电泳。象称为电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳。区区带带电电泳泳是是在在半半固固相相或或胶

2、胶状状介介质质上上加加一一个个点点或或一一薄薄层层样样品品溶溶液液，然然后后加加电电场场，分分子子在在支支持持介介质质上上或或支支持持介介质质中中迁迁移移。支支持持介介质质的的作作用用主主要要是是为为了了防防止止机机械械干干扰扰和和由由于于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。区区带带电电泳泳使使用用不不同同的的支支持持介介质质，早早期期有有滤滤纸纸、玻玻璃璃珠珠、淀淀粉粉粒粒、纤纤维维素素粉粉、海海砂砂、海海绵绵、聚聚氯氯乙乙烯烯树树脂脂；以以后后有有淀淀粉粉凝凝胶胶、琼琼脂脂凝凝胶胶、醋醋酸酸纤纤维维素素膜膜，现现在在则则多多用用聚聚丙烯酰

3、胺（丙烯酰胺（PAGEPAGE）和琼脂糖凝胶。）和琼脂糖凝胶。PAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连连续续系系统统和和不不连连续续系系统统两两大大类类，连连续续系系统统电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同，带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下，主主要要靠靠电电荷荷和和分分子子筛筛效效应应。不不连连续续系系统统中中由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分，pHpH，凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛筛效效应应，还还具具有有浓浓缩缩效

4、效应应，因因而而其其分分离离条条带带清晰度及分辨率均较前者佳。清晰度及分辨率均较前者佳。低电荷密度区浓缩胶 胶孔大小，电压梯度电荷分布不均匀导致的电压梯度变化，快离子、慢离子分离胶Ph=6.7Ph=8.9电泳缓冲液由Tris、甘氨酸、cl-、SDS组成,甘氨酸等电点=5.97U=IRF=EQ=U/D*QSDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳，是是在在聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶系系统统中中引引进进SDSSDS（十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠），SDSSDS能能断断裂裂分分子子内内和和分分子子间间氢氢键键，破破坏坏蛋蛋白白质质的的二二级级和和三三级级结结构构，强强还还原原剂剂能能使使

5、半半胱胱氨氨酸酸之之间间的的二二硫硫键键断断裂裂，蛋蛋白白质质在在一一定定浓浓度度的的含含有有强强还还原原剂剂的的SDSSDS溶溶液液中中，与与SDSSDS分分子子按按比比例例结结合合，形形成成带带负负电电荷荷的的SDS-SDS-蛋蛋白白质质复复合合物物，这这种种复复合合物物由由于于结结合合大大量量的的SDSSDS，使使蛋蛋白白质质丧丧失失了了原原有有的的电电荷荷状状态态形形成成仅仅保保持持原原有有分分子子大大小小为为特特征征的的负负离离子子团团块块，从从而而降降低低或或消消除除了了各各种种蛋蛋白白质质分分子子之之间间天天然然的的电电荷荷差差异异，由由于于SDSSDS与与蛋蛋白白质质的的结结合

6、合是是按按重重量量成成比比例例的的，因因此此在在进进行行电电泳泳时时，蛋蛋白白质质分分子子的的迁迁移移速速度度取取决决于于分分子子大大小小。当当分分子子量量在在15KD15KD到到200KD200KD之之间间时时，蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率和和分分子子量量的的对对数数呈呈线线性性关关系系，符符合合下下式式：logMW=K-bXlogMW=K-bX，式式中中：MWMW为为分分子子量量，X X为为迁迁移移率率，k k、b b均均为为常常数数，若若将将已已知知分分子子量量的的标标准准蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率对对分分子子量量对对数数作作图图，可可获获得得一一条条标标准准曲曲线线，未未知知蛋蛋白白

7、质质在在相相同同条条件件下下进进行行电电泳泳，根根据据它它的的电电泳泳迁迁移移率率即即可可在在标标准准曲曲线线上上求求得分子量。得分子量。SDSSDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与是样品制备过程中蛋白质与SDSSDS的结合程度。影的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：响它们结合的因素主要有三个：1)1)溶液中溶液中SDSSDS单体的浓度，当单体浓度大于单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L1mmol/L时大多数蛋白质与时大多数蛋白质与SDSSDS结合的重量比结合的重量比为为1:1.41:1.4，如果单休浓度降到，如果单休浓

8、度降到0.5 mmol/L0.5 mmol/L以下以下时，两者的结合比仅为时，两者的结合比仅为1:0.41:0.4这样就不能消除蛋这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDSSDS的充的充分结合，它们的重量比应该为分结合，它们的重量比应该为1:41:4或或1:31:32)2)样品缓冲液的离子强度。样品缓冲液的离子强度。SDSSDS电泳的样品缓冲液电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是离子强度较低，通常是1010100mmol/L100mmol/L3)3)二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原采采用用SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳

9、泳法法测测蛋蛋白白质质分分子子量量时时，只只有有完完全全打打开开二二硫硫键键，蛋蛋白白质质分分子子才才能能被被解解聚聚，SDSSDS才才能能定定量量地地结结合合到到亚亚基基上上而而给给出出相相对对迁迁移移率率和和分分子子量量对对数数的的线线性性关关系系。因因此此在在用用SDSSDS处处理理样样品品同同时时往往往往用用巯巯基基乙乙醇醇处处理理，巯巯基基乙乙醇醇是是一一种种强强还还原原剂剂，它它使使被被还还原原的的二二硫硫键键不不易易再再氧氧化化，从从而而使使很很多多不不溶溶性性蛋蛋白质溶解而与白质溶解而与SDSSDS定量结合。定量结合。有有许许多多蛋蛋白白质质是是由由亚亚基基（如如血血红红蛋蛋白

10、白）或或两两条条以以上上肽肽链链（如如胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶）组组成成的的，它它们们在在SDSSDS和和巯巯基基乙乙醇醇作作用用下下，解解离离成成亚亚基基或或单单条条肽肽链链，因因此此这这一一类类蛋蛋白白质质，测测定定时时只只是是它它们们的的亚亚基基或单条肽链的或单条肽链的MWMW。已已发发现现有有些些蛋蛋白白质质不不能能用用SDS-PAGESDS-PAGE测测定定分分子子量量。如如电电荷荷异异常常或或构构象象异异常常的的蛋蛋白白质质，带带有有较较大大辅辅基基的的蛋蛋白白质质（某某些些糖糖蛋蛋白白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。一般至少采用两种方法测定未知样

11、品的分子量，互相验证。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。三三.实验试剂和器材实验试剂和器材 1.材料：材料：低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒:低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白根据说明书处理标准蛋白 样品：称样品：称3mg样品，加样品，加2 ml蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。2.实

12、验试剂实验试剂 (1)30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）：称）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺(交交 联剂联剂)（Bis）0.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶，过滤后置棕色瓶 4贮存可用贮存可用1-2月。月。（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取Tris18.2g，加入加入50ml水，用水，用1mol/L盐酸调盐酸调pH8.8，最后用蒸馏最后用蒸馏 水定容至水定容至100ml。（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取Tris12.1g

13、，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/L盐酸调盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水最后用蒸馏水 定容至定容至100ml。（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取Tris0.6g，加，加 入入50ml水，用水，用1mol/L盐酸调盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定，最后用蒸馏水定 容至容至100ml。（7）10%过硫酸铵过硫酸铵(AP)（催化剂，引发剂）（催化剂，引发剂）（8）TEMED（四甲基乙二胺）（加速剂）（四甲基乙二胺）（加速剂）（9）样品溶解液：）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（溴酚蓝（2mg）+甘油（甘油（2

14、g）+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至），最后定容至10ml。（10）固定液：取）固定液：取50%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混匀。混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液，加上述固定液 250ml，过滤后备用。过滤后备用。（12）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇，甲醇50ml，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至1000ml。（13）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘甘氨酸缓冲液氨酸缓冲液pH8.3）：称）：称Tri

15、s6.0g，甘，甘 氨酸氨酸28.8g，加入，加入SDS1g，加，加蒸馏水使其溶解后定容至蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。3.实验器材实验器材垂直板电泳装置垂直板电泳装置直流稳压电源直流稳压电源移液管移液管滤纸滤纸 微量注射器微量注射器大培养皿大培养皿各部分凝胶配制各部分凝胶配制四四.实验过程实验过程 1.1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备准备2 2个干净的锥个干净的锥形瓶形瓶.2.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好.固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板坏玻璃板.3.3.按比例配好分离胶按比例

16、配好分离胶,用移液管快速加入用移液管快速加入,大约大约5 5厘厘米左右米左右,之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水,静置静置4040分钟分钟.凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速,催化剂催化剂TEMEDTEMED要在注胶前要在注胶前再加入再加入,否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性注胶过程最好一次性完成完成,避免产生气泡避免产生气泡.水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气空气 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面界面.4.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按

17、比例配好按比例配好浓缩胶浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm处处,迅速迅速插入样梳插入样梳,静置静置4040分钟分钟.样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡,梳底梳底需水平需水平.5.5.在上槽内加入缓冲液后在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳拔出样梳。要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果否则会影响加样效果.6 6、加样加样（1）取取10l标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于EP管内，再加入管内，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为10l。（2）取取10l样品溶液，再加入样品溶

18、液，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样量倍样品缓冲液，上样量分别为分别为5l和和3l。7.7.用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前加样前,样品在样品在 沸水中加热沸水中加热3 3分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。注射器不可过低注射器不可过低,以防刺破胶体以防刺破胶体,也不可过高也不可过高,在样下在样下 沉时会发生扩散沉时会发生扩散.为避免边缘效应为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样最好选用中部的孔注样.8.8.电泳槽中加入缓冲液电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳接通电源，进行电泳，开始电流恒，开始电流恒定在定在10mA，当进入分离胶后改为，当进

19、入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘约约5mm时，停止电泳。时，停止电泳。9.9.凝胶板剥离凝胶板剥离与与染色染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。小时左右。10.10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。色，直到蛋白质区带清晰。剥胶时要小心剥胶时要小心,保持胶完好无损保持胶完好无损,染色要充分染色要充分.11.11.实验结果分析实验结果分析。五五.分析计算

20、分析计算绘制标准曲线：绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：按下式计算相对迁移率：以每个蛋白标准的分子量对数对它的以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。样品的分子量测定才具有可靠性。六六.思考题思考题在在不不连连续续体体系系SDS-PAGESDS-PAGE中中,当当分分离离胶胶加加完完后后,需在其上加一层水需在其上加一层水,为什么为什么?样品溶解液中各种试剂的作用是什么样品溶解液中各

21、种试剂的作用是什么?在在不不连连续续体体系系SDS-PAGESDS-PAGE中中,分分离离胶胶与与浓浓缩缩胶中均含有胶中均含有TEMEDTEMED和和AP,AP,试述其作用试述其作用?思考题：思考题：注意事项注意事项丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超过最大暴露量不超过0.5g/kg，皮肤接触可，皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作机能失调、四肢无力等。机能失调、四肢无力等。丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤不要接触皮肤，戴手套、口罩操作不要接触皮肤，戴手套、口罩操作注意事项：注意事项：没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近一定要催化充分，使之完全聚合一定要催化充分，使之完全聚合集中处理，实验中全部的胶由专门受过训集中处理，实验中全部的胶由专门受过训练的人收集到一起，在一个特殊标明的容练的人收集到一起，在一个特殊标明的容器中保存，并进一步催化使之反应完全，器中保存，并进一步催化使之反应完全，最后送交学校危险品仓库，统一处理。最后送交学校危险品仓库，统一处理。