小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离(5页).docx

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1、-小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离-第 5 页小鼠尾静脉取血所需器材：热光源（如：普通台灯），鼠尾固定器，刀片，1.5mlEP管。步 骤：1. 烘烤。用热源烘烤小鼠使其血管膨胀。烤至小鼠开始有剧烈反应时，关掉热源。2. 割尾。烤完后将小鼠固定将尾部露在外面，用刀片割一下鼠尾远心端腹侧静脉血管使血液流出，立即用1.5mlEP收集滴下来的血液。3. 止血。用干棉球按压伤口或按压尾部近心端止血，以防失血过多死亡。 要点1.烤： 烤的不够：血管未膨胀，割尾后血液不易流出。 烤的太过：小鼠死亡。 2.割：割的太浅：血液不流出。割的太深：鼠尾被割断。后续应用：取血时可根据需要选择是否需加抗凝剂。所取血可用于

2、血液学指标的检测，如EPO浓度、甘油三酯浓度、红细胞数及红细胞压积等。附表：本实验室常用的2种取血方法的比较尾静脉取血VS 眼眶后静脉丛取血尾静脉取血眼眶取血取血量（小鼠）200-300ul200-300ul多次取血可以可以简便易学是否动物损伤小大，损伤脑神经操作时间慢快小鼠脾淋巴细胞分离所需器材（以下均为取1只鼠脾需准备的量）：手术器械剪刀、镊子至少2套（高压灭菌），止血钳一个（高压灭菌），细头玻璃吸管一根（高压灭菌），200目尼龙网一张（高压灭菌），一次性5ml注射器一支，15ml和50ml离心管各一个，60mm中皿及血球计数板一块。所需试剂：小鼠淋巴细胞分离液，无血清1640，进口血清，

3、青链霉素（双抗）（100X），NEAA，丙酮酸钠，谷氨酰胺，-巯基乙醇注：200目尼龙网和小鼠淋巴细胞分离液均从达科为公司购买。分离原理示意图图一 小鼠脾脏研磨示意图 图二 离心后小鼠脾细胞分层示意图 分离步骤及要点：1. 断颈处死小鼠，75%乙醇中浸泡几分钟消毒。2. 将小鼠转移至超净台中，先用一套剪刀和镊子剪开小鼠皮肤使腹腔内脾脏可见。换一套干净的剪刀和镊子剪开腹腔，小心用镊子夹出脾脏，用剪刀尽量去除附着其上的脂肪组织。脾脏位于小鼠左侧腹部，为一暗红色长条形器官，不要误取肾和肝。取出后浸泡于RPMI1640中稍作清洗。注意无菌操作。3. 在一无菌的中皿中加入5ml淋巴细胞分离液，用止血钳将

4、尼龙膜固定在中皿上，放上脾脏开始研磨（如图一所示）。注意利用尼龙膜的弹性研磨。研磨时间不要超过5分钟，否则淋巴细胞分离液挥发导致其密度发生改变，影响分离效果。 4. 将上述中皿中的淋巴细胞分离液转移至15ml离心管，沿管壁小心加入约200ul的无血清RPMI1640，立即旋紧管盖，800g室温离心30分钟。注意室温离心！加速度如有10档，设为第3档。5. 离心后细胞分层如上图二所示。用细头玻璃吸管将淋巴细胞层吸出至50ml离心管中，加入10倍体积无血清1640培养基，混匀后250g 室温离心10 分钟。6. 小心弃去上清，用1ml淋巴细胞培养基重悬细胞计数，稀释200倍计数。一般能取到0.5-1*108个/脾。按适当密度种至培养皿中，37度，5%CO2培养。 注意全程无菌操作！注：此处所分离细胞为单个核细胞（PBMC），为细胞混合物，其中主要是淋巴细胞，淋巴细胞中又以B淋巴细胞为主。后续试验：分离到的淋巴细胞可继续用磁珠分选纯的B细胞、T细胞做相应检测（提基因组，提蛋白检测某基因表达等），在本人实验中分选到的淋巴细胞使用LPS刺激后只有B淋巴细胞增殖，之后使用逆转录病毒感染，将感染的B淋巴细胞作为基因治疗的靶细胞。