微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析教案资料.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析-微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析摘要：通过比较分析羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法3种检测方法的准确性、简便性、经济性，找到适合于测定微生物发酵饲料中乳酸含量的方法。试验结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本高；EDTA定钙法检测虽然简便、迅速，但准确性最差；羟基联苯比色法检测效果居中，较为准确和方便。因此，乳酸脱氢酶法适合于高精度、高效率的检测；EDTA定钙法适合于迅速简便、精度要求不高的检测；羟基联苯比色法可作为企业或科

2、研单位精度要求不高的常规检测。关键词：发酵饲料；乳酸；羟基联苯比色法；EDTA定钙法；乳酸脱氢酶法ComparativeAnalysisofAnalyticalMethodsofLacticAcidContentinMicrobialFermentationFeedsAbstract:Tofindamethodthatwasusedtomeasurethelacticacidcontentinmicrobialfermentationfeeds,theaccuracy,convenientandeconomyofhydroxybiphenolcolorimetrymethod,EDTAtitr

3、ationmethodandlacticaciddehydrogenasemethodwerecontrastedinthisstudy.Theresultsshowedthattheaccuracyofthetestresultwasbestandrapidusingthelacticaciddehydrogenasemethod,butthecostwashigher.ThetestofEDTAtitrationmethodwassimpleandrapid,buttheaccuracywasworst.Thetestresultsofhydroxybiphenolcolorimetrym

4、ethodwaspreferably,themethodshadgoodspecificityandconvenient.Consequently,lacticaciddehydrogenasemethodwasfitforthetestsrequirehighprecisionandhighefficiency.TheEDTAtitrationmethodwasfitforthetestsrequiresimpleandrapid,buttheaccuracydidntaskformuch.Thehydroxybiphenolcolorimetrymethodwasusedforroutin

5、eundemandingaccuracytestresultinenterpriseorinstitutesofscientificresearch.Keywords:microbialfermentationfeeds;lacticacid;hydroxybiphenolcolorimetrymethod;EDTAtitrationmethod;lacticaciddehydrogenasemethod收稿日期：2012-03-22基金项目：龙岩市科技计划重点项目（2011LY18）作者简介：罗建（1962），男，福建龙岩人，硕士，研究方向为饲料的研发、生产与应用。*通讯作者：教授，硕士生导

6、师，E-mail：Lyyxy1988。37饲料博览2012年第5期检测分析微生物发酵饲料的生产与应用是近年来饲料工业和养殖业最热门的话题之一。随着人民生活水平的不断提高和环境资源的日益恶化，利用农副产品和轻工副产物生产高质量、无污染的微生物发酵饲料已成为缓解饲料资源短缺、提高畜禽产品品质、减少畜产品药物抗生素残留的重要手段1。微生物发酵饲料的生产菌种主要有乳酸菌、酵母菌和芽孢菌，其中乳酸菌包括发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌3种2。乳酸菌是发酵的主角，其在厌氧条件下大量繁殖占支配地位时产生大量的乳酸，抑制其他不良微生物的生长繁殖，从而制成了优质的微生物发酵饲料3。因此，发酵饲料中乳酸含量的高低

7、是判断微生物发酵饲料品质优劣的一个重要指标。目前，乳酸含量的测定方法主要有羟基联苯比色法、EDTA定钙法、高效液相色谱法（HPLC）、酶法等，均有各自的适用范围和优缺点4-7。本文通过比较分析微生物发酵饲料中不同乳酸测定方法，以期得到适合于中小型饲料厂或科研单位快速、简便检测产品乳酸含量的方法。1材料与方法1.1试验材料微生物发酵饲料由福建省龙岩市金和动物饲料有限公司提供。在规定的发酵时间内发酵完成后取样品1g，测定其乳酸含量。1.2乳酸测定方法1.2.1羟基联苯比色法标准曲线的绘制：分别配置乳酸标准液1、2、3、4、5、6gmL-1，在比色管中分别加入乳酸标准液1mL、4.0%硫酸铜溶液0.

8、05mL，再加入浓硫酸6mL，反应5min，冷却至20以下后，再分别于各比色管中加入1%碱溶性羟基联苯溶液0.05mL，混合均匀，在室温下放置68h，过夜，在570nm下进行比色测定，绘制出标准曲线8。样品测定：1g发酵饲料溶解于100mL蒸馏水中，4000rpm离心10min，取上清液1mL，按标准曲线测定样品中乳酸含量（%）。1.2.2EDTA定钙法称取样品1g（准确至0.0002g）于100mL杯中，加水80mL，在电炉上加热至近沸，继续加热5min（溶液不要溢出），冷却，定容至100mL，待溶液澄清后（或过滤），吸取上清液（滤液）10mL于锥形瓶中，加三乙醇胺10mL、蒸馏水50mL、

9、200gL-1氢氧化钠溶液10mL、盐酸羟胺0.5g摇匀后，再加钙混合指示剂少许，立即用EDTA标准溶液0.05moLL-1滴定，溶液呈现纯蓝色为滴定终点。乳酸的测定结果计算公式见式（1）。乳酸浓度（gL-1）=90.08CV（1）式中，V为滴定所消耗EDTA溶液体积（mL）；C为EDTA浓度（moLL-1）；90.08为乳酸的摩尔质量。为便于与其他方法测定结果比较，乳酸的测定结果最终转换成每克饲料乳酸含量（%）。1.2.3乳酸脱氢酶法酶法测定乳酸含量操作步骤见表1。酶法乳酸检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司，按照其使用说明，预先配置好酶工作液和反应显色剂（标准液和终止液试剂盒中已配好，直

10、接使用）。取饲料样品1g溶解于50mL蒸馏水中，4000rpm离心10min，取上清液待测，蒸馏水调零，测定波长为530nm。测定结果计算公式见式（2）。式中，C为样品浓度mmoLL-1；50为样品稀释倍数。同理，乳酸的测定结果最终转换成每克饲料乳酸含量（%）。2结果与分析2.13种方法测定发酵饲料乳酸含量分别采用羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法测3种方法对同一发酵批次的微生物发酵饲料进行测定，取样3批、每批重复3次，进行统计学分析，结果见表2。试剂蒸馏水3mmoLL-1标准液样本酶工作液显色剂混匀，37水浴准确反应10min终止液加样管空白管0.0210.22标准管0.0210.

11、22测定管0.0210.22表1酶法测定乳酸含量操作步骤mL乳酸浓度（mmoLL-1）=（2）382012年第5期饲料博览检测分析由表2可知，同一批次间和不同批次间检测，平均误差最小的方法是乳酸脱氢酶法，最差的是EDTA定钙法；对于同一批次检测结果，羟基联苯比色法和乳酸脱氢酶法检测结果差异不显著（P0.05），而与EDTA定钙法差异显著（P0.05）。2.23种方法测定发酵饲料乳酸含量应用性分析3种方法测定发酵饲料乳酸含量应用分析结果见表3。由表3可知，3种方法中，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好，操作也最为简便，且检测时间也最短，但成本较为昂贵；EDTA定钙法虽然操作简便，检测时间也不太长，但检

12、测准确性最差，误差较大，结果较不可靠；羟基联苯比色法检测效果处于另外两个方法之间，检测较为准确和方便。3讨论发酵饲料中乳酸含量的高低是判断其产品品质优劣的一个非常重要指标，但目前我国对饲料中乳酸含量的测定方法报道较少。本文探讨了3种检测发酵饲料中乳酸含量的方法，结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本较高，该方法适用于某特定时期抽检样品，需迅速得到准确结果的场合；EDTA定钙法检测的准确性最差，但操作简便、迅速，只适用于只需得到检测样品乳酸含量大概数值的场合；羟基联苯比色法检测效果居中，可作为企业或科研单位精度要求不高的常规检测发酵饲料样品中乳酸含量的一种方法。发酵液中乳酸含量的测

13、定方法还有HPLC法、生物传感器法等。这两种方法检测结果可靠、快捷迅速、专业性强，并可同时检测产品中其他物质（如有机酸、葡萄糖等）的含量。樊永红试验结果表明，在同一发酵批次的乳酸含量测试中，EDTA定钙法与HPLC法、生物传感仪法有显著差异（P0.05）；EDTA定钙法简便快速，但重复性差；HPLC法准确、灵敏；生物传感仪测定法比较准确和方便9。如发酵饲料生产企业有财力购置相关的设备，此方法也可作为微生物发酵饲料中乳酸含量的检测方法，检测结果可能更为真实可靠。参考文献1陆文清.发酵饲料生产与应用技术M.北京:中国轻工业出版社,2011.2林标声,罗建,戴爱玲,等.微生物发酵饲料对断奶仔猪生长性

14、能的影响J.安徽农业科学,2010,38（5）:2378-2380.3余伯良.发酵饲料生产与应用新技术M.北京:中国农业出版社,1999.4高庆,印建和,穆华容,等.对羟基联苯法测定啤酒中乳酸J.酿酒,2005（6）:93-95.5郑志,姜绍通,潘丽军.EDTA定钙法测定发酵液中乳酸含量的探讨J.食品科学,2003,24（3）:102-105.6白冬梅,班睿,赵学明,等.反相高效液相色谱法测定米根霉乳酸发酵液中的乳酸J.色谱,2000,18（6）:527-528.7柳畅先,度浔,吴士钧.酶法测定乳酸J.分析试验室,2005,24（9）:75-77.8梁琼,鲁明波,卢正东,等.对羟基联苯法定量测

15、定发酵液中的乳酸J.食品科学,2008,29（6）:357-360.9樊永红,王丽,柳丹,等.米根霉发酵液中乳酸含量的测定方法研究J.生物技术,2007,17（1）:54-55.注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），肩标不同大写字母者表示差异极显著（P0.05）。提取方法羟基联苯比色法EDTA定钙法乳酸脱氢酶法准确性较好较差最好成本居中便宜昂贵操作繁简较繁琐简便简便检测时间较长适中很短测定方法羟基联苯比色法EDTA定钙法乳酸脱氢酶法乳酸含量/%批次11.070.012a1.180.185b0.990.008a批次20.900.018a0.990.178b0.950.008a批次30.950.020a1.260.147b0.960.006a平均误差0.0870.1400.020表2不同测定方法测定同一批次发酵饲料的乳酸含量表33种方法测定发酵饲料乳酸含量应用分析39-