DB65∕T 3969-2016 羊梭菌病防控技术规程(新疆维吾尔自治区).pdf

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1、ICS 65.020.30 B 41 新疆维吾尔自主J口DB65 区地方标准DB 65/T 3969-2016 羊梭菌病防控技术规程The Technical Regulation for Controlling of Clostridiosis in Sheep 201612-30发布2017-01-30实施新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布D865/T 3969-2016 目IJ昌本标准按GB/T1.1-2009 标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写的要求编制。本标准由新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。本标准起草单位

2、:新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)。本标准主要起草人:陈世军、韩涛、党新生、秦荣艳、王杰、袁燕、沈辰峰、王力俭、黄炯、杨会国、樊华、郭会玲、薛晶、金映红I DB65/丁3969-2016羊梭菌病防控技术规程1 范围本标准规定了羊梭菌病的术语和定义、诊断和防控要求。本标准适用于肉羊养殖场(户)、牧场和动物诊疗单位对羊梭菌病的诊断与防控。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程N

3、Y/T 5030一2016无公害农产品兽药使用准则NY 5032-2016 无公害食品畜禽饲料和饲料添加剂使用准则NY/T 5151 无公害食品肉羊饲养管理准则NY 5149 无公害食品肉羊饲养兽医防疫准则3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 羊梭菌病clostridiosis of sheep 由梭菌属(Clostridium)中的病原菌引起的羊传染性疾病的总称，包括羔羊病疾、羊猝犯、羊肠毒血症、羊快疫及羊黑疫五种羊传染病。这类疾病的共同临床特点是急性死亡(指无明显临床症状突然死亡，或临床症状出现到死亡不超过24h)和病死率高。3.2 羔羊病疾lamb dysentery 病原为

4、B型产气英膜杆菌，以腹泻和小肠出血溃荡，回肠外观如红肠子样的新生羔羊急性致死性传染病。3.3 羊猝猩struck 病原为C型产气英膜杆菌，以急性死亡、腹膜炎、溃殇性肠炎和死后肌肉出现气肿瘟样病变为特征的，6-24月龄羊多发的急性致死性传染病。3.4 羊肠毒血症enterotoxaemia 1 DB65/T 3969-2016 病原为D型产气英膜杆菌，以急性死亡、肠粘膜脱落或溃荡，死后肾脏肿大、实质柔软、触压即朽烂为特征的，3-12月龄羊多发的急性致死性传染病。3.5 羊快疫bradsot/braxy 病原为腐败梭菌，以突然死亡，胃底或幽门区点、斑状或弥漫性出血为特征，6r-.J 18月龄羊多发

5、的急性致死性传染病。3.6 羊黑疫black disease 病原为B型诺维氏雨，以尸体迅速腐败，皮肤呈黑色外观，肝脏出现特异性坏死灶为特征，2-4岁羊多发的急性致死性传染病。4 诊断要求4.1 羔羊病疾4.1.1 流行病学特点主要危害1周龄内的羔羊，以2-5日龄发病最多。主要通过消化道感染，也可通过脐带或创伤感染。母羊营养不良、产羔季节严寒或气候炎热时多发。4.1.2 临床症状潜伏期为1dr-.J2 d，人工感染贝则5h-郁、低头弓背，进而拒食、喜卧，持续性腹泻。粪便或粘稠如糊，或稀薄如水，初为土黄色，后棕色，恶臭，最后为血便。后期病羔大便失禁，脱水、虚弱、卧地不起，死亡。病程多为1dr-.

6、J2 d。有的病例腹胀不腹泻，或只排少量血色稀便，主要出现神经症状，四肢瘫软，呼吸迫促，口流白沫，角弓反张，体温低于正常，很快死亡。病程数小时至十几小时。4.1.3 病理剖检病死羊剖检可见:a)月工周被稀便污染，尸体严重脱水;b)小肠(尤其是因肠)呈出血性肠炎变化，肠内充满血样物，状如血肠，俗称红肠子病c)肺脏充血有暗色胶血斑。心包有淡黄色积液，心内、外膜有出血点或斑;d)病程稍长时见小肠或结肠结膜出现直径多在1mm,-.,2 mm的溃殇，溃殇周围有一出血带，镜检呈出血性或坏死性肠炎变化;e)真胃内有未消化的凝乳块，肠系膜淋巴结充血肿大或出血，其他实质器官变性或肿大04.1.4 实验室诊断4.

7、1.4.1涂片镜检病料(肠内容物或病变部肠教膜)涂片染色镜检，见大量英膜肥厚、两端稍方、短粗的革兰氏阳性大杆菌(1m，-.，1.5mx2m，-.，8m)，多单独存在，也有成双排列的。少数菌体中有椭圆形的芽础，位于菌体中央或略微偏端。肠道中菌体较多，肝脏、脾脏、肾脏和淋巴结涂片可见少量菌体。2 DB65/T 3969一-20164.1.4.2 细菌分离及生化反应试验羔羊病疾病原菌的细菌分离和生化反应的具体内容如下:a)无菌采取肾、肝、心、血液等病料，接种于厌氧肝汤中，37 oc培养3h-4h后，肝汤产气浑浊，此时将肝汤培养物接种于鲜血琼脂平板上，在厌氧条件下37oc培养18h-24 h，可见长出

8、圆形、光滑、隆起、边缘整齐、淡灰色菌落，培养72h后可见菌落为中央隆起、表面有放射状条纹、边缘呈锯齿状、灰白色、半透明、直径2mm-5 mm的勋章样。菌落周围有一日溶血环，之外还有一圈不完全溶血环，即所谓双重溶血环。在乳糖卵黄琼脂平板上，菌落周围可形成乳白色浑浊圈(细菌产生卵磷脂酶分解卵黄中的卵磷脂)。取其培养物涂片、染色、镜检，可观察到大量散在、成双、两端钝圆、革兰氏阳性短粗大杆菌。为了获得纯培养物，可在接种病料后将厌氧肝汤在65oc加热15min后再进行培养;b)将无菌采集的肝、脾、肾病料剪碎呈小块，分别接种于厌氧肉肝汤培养基中，置于37oc恒温箱中培养5h-6 h，即呈浑浊生长，并产生大

9、量气体24h后，肉肝汤浑浊，产生气泡，管底形成白色沉淀物;c)石恋牛乳培养基中产酸、产气并凝固，由于气体膨胀使凝乳块断裂，呈现明显的汹涌发酵反应或称暴力发酵该特点可用于本菌的快速鉴定:d)生化反应实验结果显示，本菌能发酵葡萄糖、乳糖、庶糖、麦芽糖、淀粉并产生气体;可分解水杨背、甘油;不发酵甘露醇和卫矛醇。4.1.4.3 动物回归试验以培养18h的厌氧肝汤培养物0.2mL在豚鼠腿部行肌内注射，豚鼠于24h左右死亡，注射局部形成气性坏瘟。以局部病灶取病料涂片染色镜检，有大量的两端钝圆、短粗的革兰氏阳性大杆菌存在，而血液涂片则细菌极少。对照豚鼠(注射空白厌氧肝汤)则不死亡。对鸽子肌肉接种具有更典型的

10、气体捻发音。小鼠的易感性较豚鼠差。4.1.4.4菌型鉴定主要采取病死羊的回肠及其内容物。用标准产气英膜梭菌抗毒素与处理得到的肠内容物上清液做中和试验。羔羊病疾病原菌为B型产气英膜梭菌。操作方法详见附录A。4.2 羊猝祖4.2.1 流行病学特点6月龄至2岁绵羊易感，成年羊多发。山羊亦可感染。主要是食入被本菌污染的饲草、饲料及饮水等，经消化道感染。散发或呈地方流行性，多见于早春和秋冬的低洼、沼泽牧场。4.2.2 临床症状突然发病，常在3h-6h内死亡，或见不到症状即死亡。早期症状不明显，有时可见病羊掉群，卧地，突然沉郁，剧烈痊孪，倒地磨牙，眼球突出，惊厥死亡。4.2.3 病理剖检病死羊剖检可见:a

11、)死亡8h尸检可见骨路肌出现气肿痕样病变，即肌问积聚带气泡和酸腐气味的血样液体，此病变具有特殊诊断意义:b)小肠一段或全部呈出血性肠炎变化，有的肠段可见廉烂和溃殇;3 D865/T 3969一-2016c)由于细菌及其毒素作用，见胸腔、腹腔与心包腔中有大量渗出液，后者暴露于空气中形成纤维素j疑块，浆膜有出血点:d)肾肿大，但不软。4.2.4 实验室诊断4.2.4.1涂片镜检用肠内容物或病变部肠结膜涂片，见4.1.4.10 4.2.4.2毒素检查取病死羊回肠内容物经5倍生理盐水稀释，3000 r/min离心15min取上清液过滤。上清液分成2份，1份不加热，1份60oc处理30mi口，分别给小鼠

12、静脉注射O.1 mLr-O.3此，或家兔静注1mLr-3此，如加热组不死亡，不加热组动物于数分钟至十几小时内死亡，说明有产气英膜梭菌毒素存在。4.2.4.3菌型鉴定主要采取病死羊的回肠及其内容物。用标准产气英膜梭菌抗毒素与处理得到的肠内容物上清液做中和试验。羊猝犯病原菌为C型产气英膜梭菌。操作方法见附录A。4.3 羊肠毒血症4.3.1 流行病学特点2月龄至2岁绵羊多发，山羊较少发病，以2r-12月龄的绵羊最易感。多散发，多发于春夏或秋冬换季时。4.3.2 临床症状过食是重要的发病诱因，突然发生，很快死亡，很难看到症状，或刚发现症状后便死亡，病程为2hr-4 h，有的只有数分钟，无抢救时间。病情

13、缓慢的病例，可延至12h或2dr-3 d死亡。可见羊只表现不安，有腹痛症状，肚胀，离群呆立，独自奔跑或卧下。病羊死前步态不稳，呼吸急促，心跳加快，全身肌肉震颤，磨牙甩头，倒地抽搞，角弓反张，鼻流白沫，眼结膜和口数膜苍白，四肢和耳尖发冷，发出哀鸣。部分病羊以抽撞为特征，倒毙前四肢出现强烈的划动，肌肉抽撞，磨牙，流涎，头颈显著抽擂。部分病羊则发生腹泻，排黑色或深绿色稀粪。病羊体温一般不高，病死率很高。临死前出现明显的高血糖和糖尿。4.3.3 病理剖检4 病死羊剖检可见:a)尸体僵硬，腹部膨大，口鼻流出泡沫状液体或黄绿色胃内容物;b)全身淋巴结肿大，切面呈黑褐色;c)胸腔、腹腔及心包腔内积液色黄，内

14、含纤维素絮块:d)小肠呈轻度卡他性炎症，严重病例小肠勃膜出血，肠壁外观血红色，肠腔充满血色内容物。真胃内有未消化的饲料。肝稍肿大，质脆。胆囊肿大充盈;e)肾肿大，质软如泥，触压即朽烂，故俗称软肾病为羊肠毒血症的特征性病理变化。膀脱内积有茶色尿液。膀脱教膜有密集的针尖状出血点:f)肺充血、气肿，表面散在出血斑，气管和支气管内有许多白色泡沫:D865/T 3969-2016 g)心脏扩张，有时含有气泡，左心室内外膜有出血点，心耳部脂肪黄染，房室瓣膜水肿，有胶冻样渗出物;h)胸腺出血。4.3.4 实验室诊断4.3.4.1涂片镜检用病死羊小肠内容物、肾、淋巴结和肝涂片和触片，染色镜检，可见有单在或成双

15、排列、两端稍方、革兰氏阳性的短粗大杆菌，菌体周围见有折光性较强的肥厚英膜;小肠内容物涂片除了见革兰氏阳性大杆菌外，还可见到一些位于菌体中央或偏近端、卵圆形、直径大于菌体的芽抱。4.3.4.2细菌分离及生化反应试验羊肠毒血症病原的细菌分离及生化反应使用内容见4.1.4.20 4.3.4.3动物试验本菌对豚鼠、小鼠、家兔和鸽子均有致病力。动物回归试验见4.1.4.304.3.4.4菌型鉴定用标准产气英膜梭菌抗毒素与病羊肠内容物处理所得上清液做中和试验，定型为D型产气英膜梭菌。操作方法见附录A。4.3.4.5血糖和尿糖检查检查病死羊血液和尿液，可发现血糖明显升高，尿液葡萄糖强阳性。4.4 羊快疫4.

16、4.1 流行病学特点绵羊最易感，山羊和鹿也可感染发病。发病羊多在6r-J18月龄之间，营养状体较好的绵羊多发。主要经消化道感染。多发于秋、冬、早春气候剧变的寒冷霜降时。腐败梭菌通常以芽抱的形式散布于自然界中，潮湿低洼的环境以及寒冷、饥饿常可促使发病。4.4.2 临床症状突然发病，往往未见症状就已死亡。常见病羊放牧时死在牧场上或清晨发现死于圈内，多是营养状态较好的羊只。有的病羊死前可见痛痛、服气，眼结膜发红，磨牙呻吟，倒地痊孪抽搞，口内流出带血泡沫，多于数分钟至数小时之内死亡。4.4.3 病理剖检病死羊剖检可见:a)尸体迅速腐败，腹部膨胀，皮下组织胶冻样;b)真胃出血坏死性炎症，站膜肿胀、充血，

17、结膜下层水肿，因门及胃底部粘膜见点、斑状或弥漫性出血，并可见溃荡和坏死灶;c)肠道内充满气体或气泡，劲膜也见充血、出血;d)腹腔、胸腔、心包腔大量积液，积液接触空气易凝固:e)心内、外膜可见点状出血;f)胆囊多肿胀，肠道和肺脏浆膜出血。5 DB65/T 3969-2016 4.4.4 实验室诊断4.4.4.1组织触片镜检取病死羊心、牌、肝触片用革兰氏染色、瑞氏染色或美蓝染色，镜检可见革兰氏阳性、两端钝圆、单在或呈短链状排列的的典型大杆菌。以肝表面制作触片，用瑞士染色镜检时，除见典型的粗大杆菌外，还可见无关节、长短不等、微弯曲的长丝状菌。其他脏器涂片有时也可发现。4.4.4.2细菌培养无菌采取送

18、检病死羊的心、肝、脾、肺、肾等病料后立即进行分离培养，分别接种葡萄糖鲜血琼脂平板，37 oC厌氧培养24h，形成微微隆起、边缘厚薄不均的淡灰色菌落，菌落周围有微弱的溶血区。挑取单个菌落涂片、革兰氏染色、镜检，可见两端钝圆的革兰氏阳性粗大杆菌;挑取单个菌落接种于厌氧肝汤中，37 oC厌氧培养24h，肝汤均匀混浊，并产生有脂肪腐败的气味的气体。4.4.4.3动物接种试验试验组每只小鼠(18g-20 g)腿部肌内注射0.2mL厌氧肝汤18h培养物，对照组每只注射0.2mL 无菌生理盐水。在注射24h内试验组小鼠死亡，对照组健活。剖检死亡小鼠见接种部位肌肉出血、坏瘟，有时呈胶冻样水肿。肝触片染色镜检可

19、发现腐败梭菌无关节长丝状的特征菌体。取厌氧肝汤18h培养物3000 r/min离心15min，取上清液于耳静脉接种家兔O.5此，家兔于1h内死亡。由此可确诊该病。4.5 羊黑疫4.5.1 流行病学特点绵、山羊均发病，以2-4岁绵羊最易感，发病羊多为营养良好者。通过污染的牧草、饲料及饮水等，经消化道感染。多发于春夏季节肝片吸虫流行的低洼牧场。4.5.2 临床症状与羊快疫、羊肠毒血症极相似，病程极短，多数未见症状突然死亡。少数病程可延长至1d-2d,病羊精神沉郁，食欲废绝，反色停止，离群或呆立不动，呼吸急促，体温可升至41oC-42 oC，最后，病羊倒地磨牙，呈俯卧姿势昏迷死亡。4.5.3 病理剖

20、检病死羊剖检可见:a)死羊尸体迅速腐败，皮下组织水肿、静脉充血发黑，使羊皮呈现暗黑色，故称该病为黑疫b)肝脏肿大坏死，在其表面和深层有数目不等的灰黄色坏死灶，黄白色病灶界限清晰，形圆，直径多为2cm-3 cm，常被一充血带所包绕，其中偶见肝片吸虫的幼虫，或发现黄绿色弯曲似虫的带状病痕，具诊断意义;c)真胃幽门部和小肠教膜充血、出血;d)左心室心内膜出血;e)胸腔、腹腔和心包等浆膜腔积液，色黄，遇空气易凝固。4.5.4 实验室诊断4.5.4.1组织涂片镜检取肝坏死灶或其周围交界处组织或脾脏、心血制作涂片，染色镜检可见两端钝圆，菌体多平直或略弯曲，两两相联(也有3-4个菌体连成短链)或单在的革兰氏

21、阳性大杆菌。该菌芽J包少见，不形成英膜。6 D865/T 3969-2016 4.5.4.2细菌分离培养本菌严格厌氧。动物死亡后应及时取样(肝、脾)，接种于葡萄糖鲜血琼脂平板培养基，37 oc厌氧培养24h-48 h，可见菌落浅薄透明，形状不规则，边缘呈细线状散开，蔓延生长。4.5.4.3动物接种试验用研磨的肝病变组织混悬液肌内注射接种豚鼠，豚鼠常于1d-3 d内死亡，剖检可见注射部位有出血和水肿，皮下广泛性胶冻样水肿增厚，肝表面有大面积灰白色坏死灶。肝病料涂片染色镜检，可见4.5.4.1描述的B型诺维氏菌。5 防控要求5.1 预防5.1.1 提高羊群整体免疫力注意补充微量元素(如微量元素舔砖

22、)和控制寄生虫病，尤其是控制肝片吸虫病。饲料添加剂使用应符合NY5032-2016的规定，兽药使用应符合NY/T5030-2016的规定。5.1.2 消毒与隔离圈舍消毒，按说明使用三氯异氨尿酸、二氯异氨尿酸纳或复合盼类等消毒剂，交替使用。及时隔离病羊，妥善处理病死羊的尸体(焚烧或深埋并加垫生石灰)。消毒剂使用及防疫综合措施的实施应符合GB 16548、NY/T5030-2016的规定。5.1.3 加强饲养管理划区轮牧，在沟塘放牧时避免羊只饮用坑中的不洁积水。在易感季节，选择高燥地区放牧，尽量避免在低洼湿地放牧。农、牧区春夏之际，应尽量减少抢青，抢茬，秋季避免过食结籽饲草和蔬菜等多汁饲料，避免采

23、食过多精料。加强运动，增强抗病力，气候突变时做好保暖工作。有霜期避免羊只采食霜冻牧草。肉羊饲养管理应符合NY/T5151的规定。5.1.4 疫苗免疫在疫区，春秋两季定期注射羊黑疫疫苗和羊梭菌三联四防蜂胶灭活疫苗、羊梭菌三联四防浓缩疫苗(油乳茵)或羊快疫、肠毒血症、猝犯、羔羊病疾、羊黑疫五联疫苗为预防羔羊发生梭菌病，娃娘母羊应在产前45d和30d分别接种1次羊梭菌三联四防疫苗。羊免疫应符合NY5149的规定。5.1.5 预防性抗菌给药发病时，要及时隔离治疗发病羊，未发病的羊应全群预防性抗菌给药，可选用阿莫西林克拉维酸饵(剂量以阿莫西林计15mg/kg体重，口服或肌内注射，2次/d，连用2d-3

24、d)、多西环素(3mg/kg-5 mg/kg体重，口服，1次/d，连用2d-3 d;或2mg/kg体重，肌内注射或静脉注射，1次/d，连用2d-3 d)、长效土霉素(15mg/kg体重，肌内注射，1次/d，连用2d-3 d)等抗生素之一。羔羊病疾发病羊场，可在羔羊出生12h内开始灌服上述药物之一，用法同前。抗菌药物的使用应符合NY/T5030-2016 的规定。5.1.6 转移发病时可及时转圈，放牧羊群可转移到高燥牧场。5.1.7 使用生物制剂7 DB65/T 3969-2016 发病时，可给未发病羊注射抗血清或抗毒素预防。5.2 治疗5.2.1 尽早治疗羊梭菌病发病急，病程短，常来不及治疗便

25、己死亡，因此对于出现症状的病羊要及时采取治疗措施，越早治疗效果越好。5.2.2 抗菌羊梭菌病的抗菌治疗用药基本相同，主要可选药物如下:a)青霉素类可选用青霉素(2万U/kg3万U/kg体重，肌内注射，2次/d3次/d，连用2d3 d)、阿莫西林(15mg/kg体重，肌内注射，2次/d-3次/d，连用2d-3 d)、氮书西林(用法向阿莫西林)或阿莫西林克拉维酸饵(见5.1.5)b)囚环素类可选用土霉素(10mg/kg20 mg/kg体重，口服或肌内注射，2次/d，连用3d-5 d)、四环素(10mg/kg-20 mg/kg体重，口服，2次/d，连用2d-3 d)或多西环素(见5.1.5)c)磺胶

26、类可选用磺胶六甲氧啼皖(25mg/kg-50 mg/kg体重，首次加倍，口服、肌内注射或静脉注射，1次/d-2次/d，连用3d5 d)、复方磺胶略院专内(以SD计20mg/kg-30 mg/kg 体重，肌内注射，1次/d2次/d，连用2d3 d)、复方新诺明(以SMZ计20mg/kg-25 mg/kg 体重，口服，2次/d，连用3d5 d)、磺胶眯(0.1g/kg-0.2 g/kg体重，口服，2次/d，连用3d-5 d)。5.2.3 对症治疗在抗菌治疗的同时，还应酌情考虑对症治疗，可选用下列药物:a)轻泻排毒硫酸镇(成年羊每只30g/次100g/次，加水500mL1500 mL溶解后灌服)b)

27、止血维生素K(成年羊每只5mg/次10mg/次，肌内注射，1次/d，连用2d3 d)、盼磺乙胶(成年羊每只O.25 g/次，肌内注射，1次/d，连用2d-3 d)c)输液5%葡萄糖、O.9%氯化锅或复方盐水，根据病羊脱水程度决定总输液量，一般为10mL/kg 20 mL/kg体重:d)调整酸碱平衡5%碳酸氢铀(0.5 mL/kg 1 mL/kg体重，静脉注射，1次/d，连用2d-3 d)j e)收敛、助消化及保护胃肠新膜:1)羔羊病疾病羔:土霉素10g，胃蛋白酶10g，次硝酸锐、8g，蹂酸蛋白8g，凉开水250mLj或磺胶眯15g，乳酸钙15g，次硝酸锐、15g，革柔酸蛋白15g，凉开水250

28、mLo混悬均匀，灌服，每只羊羔每次10此，2次/d，连用2d-3 dj 2)羊快疫病羊:磺胶眯8g(或磺肢略院2.5g)，次硝酸铭、10g，睐酸蛋白5g，凉开水100 此，混匀一次灌服，1次/d，连用2d3 d。5.2.4 特殊疗法部分特殊治疗方法如下:a)羊快疫治疗的早期每只羊可灌服10%石灰乳50mL/次100mL/次，间隔12h，连用2次;b)发生羊黑疫时每只羊可肌内注射抗诺维氏梭菌血清50mL/次-80mL/次:8 DB65/T 3969-2016 c)对脱水严重的病羊可自由饮用口服补液盐溶液(配方:氯化铀3.5g，氯化钢1.5 g，碳酸氢纳2.5g，葡萄糖20g，纯净水或凉开水100

29、0mL)。对不主动饮水的病羊可灌服口服补液盐溶液，每次100mL200此，3次/d5次/d;d)治疗羊黑疫是要考虑全群驱虫，可选用:捏得净(澳盼磷)16 mg/kg体重、三氯苯瞠8mg/kg 12 mg/kg体重、丙硫眯R坐10mg/kg体重、硫双二氯盼(别丁)80 mg/kg体重或硝氯盼(拜耳9015)4 mg/kg5 mg/kg体重等;e)羔羊病疾病羔可选用36%甲瞪口此，硫酸镇60g，水1kg，溶解均匀后每只羔羊灌服30mL60 mL;6 h8 h后再灌服O.1%高锺酸饵溶液30mL60 mLo 2次/do9 DB65/T 3969-2016 附录A(规范性附录)产气英膜梭菌肠毒素的分离

30、和鉴定方法人1毒素检查羊只死亡后，尽快取小肠内容物(最好是回肠内容物)，加1%的氯仿防腐，在冷藏条件下送检。实验室在收到送检材料后，用生理盐水稀释2r-.-4倍(若内容物稀薄，不必稀释)，充分混合后经离心沉淀(3000 r/min)15 min，取上清液，用赛氏滤、器过滤后，1份直接注射动物(两只)，另l份加1%的膜蛋白酶粉，在室温处理1h以致活和1毒素，破坏P毒素，然后注射另一组动物(两只)。若无离心机和赛氏滤器，可用滤纸反复过滤，直到滤液清朗即可。动物可用小鼠(静脉注射0.2mLr-.-O.4 mL)或家兔(静脉注射2mLr-.-4 mL)。注射后至少观察24h，根据两组动物的反应情况作出

31、判断。如肠毒素含量低，动物也可能于注射后一定时间内呈现轻度昏迷，呼吸加快，经1h左右可能恢复。正常绵羊肠内容物注射后不引起反应。也可用豚鼠进行毒素检查。方法为皮内注射上述检滤液0.2mLr-.-O.4此，观察48h，如果有毒素存在，注射部可见坏死变化。A.2 中和试验A.2.1 取灭菌试管5支，编为1、2、3、4、5号，然后按表A.1所列，分别加入含毒素滤液、抗毒素和生理盐水，每管总量为1.2 mL。混合后将5个管同时放置3TC温箱中，中和40mi口。表A.1 中和试验方法加样表管肠内容物滤液抗毒素CrnL)静脉注射小鼠生理盐水CrnL)中和号CrnL)B型C型D型E型数量(只)剂量CrnL/

32、只1 0.9 0.3 2 0.4 2 0.9 0.3 2 0.4 370C,3 0.9 0.3 2 0.4 40rnin 4 0.9 O.3 2 0.4 5 O.9 0.3 2 0.4 A.2.1.1 小鼠10只，分为5组，每组2只，各组依次静脉注射上述5个管中一个管中的混合液，注射剂量为每鼠0.4mL.观察72h，按表A.2判断结果。10 D865/丁3969-2016表.2中和试验结果判定第一种第二种第二种第四种第五种第六种结果结果结果结果结果结果B型血清+肠动内物容一物+滤液活、|死毒素，考虑其他毒C型血清+肠肠内容物滤液活毒死素或毒物动物+D型血清+肠死2.检查各型血动物一+型清，尤其是B型E型血清+肠血清是否失效内容物滤液活死死死活死动物一11