GB∕T 40170-2021 质粒抽提及检测通则.pdf

《GB∕T 40170-2021 质粒抽提及检测通则.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《GB∕T 40170-2021 质粒抽提及检测通则.pdf（15页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准2021-05-21发布GB/T 40170-2021 质粒抽提及检测通则Principle of plasmid extraction and testing 国家市场监督管理总局申+国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40170-2021 目IJ1=1 本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由全国生化检测标准化技术委员会CSAC/TC387)提出并归口。本文件起草单位:中国测试技术研究院生物研究所、通用生物系统(安徽)有限公司、深圳市分析测试

2、协会、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、深圳市第二人民医院、成都市食品药品检验研究院、甘肃省商业科技研究所有限公司。本文件主要起草人:周李华、雍金贵、王利娜、喻明军、崔康乐、马丽侠、骆晓文、蒋子敬、王维坤、顾大勇、叶德萍、杨杰、何海宁。I GB/T 40170-2021 质粒抽提及检测通则1 范围本文件规定了质粒抽提及检测的术语和定义、缩略语、原则、抽提、检测、质量控制、样品保存、报告及废弃物处理。本文件适用于质粒的抽提及检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(

3、包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.3食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数GB/T 19495.1 转基因产品检测通用要求和定义GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T 34265 Sanger法测序技术指南GB/T 34796 水悔液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 质粒plasmid 细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的一个或多个闭合环状的双链DNA分子。注:存在于细胞质中，具有自主复制能力，能使其在子代细胞中也能保持恒定的拷

4、贝数，并表达所携带的遗传信息。3.2 核糖核酸酶ARNaseA 一种催化水解核糖核酸的核糖部分3和5磷酸二醋键，形成具有2，3-环一磷酸衍生物寡聚核昔酸的核酸酶。3.3 细菌内毒素bacterial endotoxin 由亲水性的杂多糖和一个共价结合的类脂A组成的复合物。注:该复合物位于革兰阴性菌细胞壁上，在细菌破裂或分解时释放，可降低细胞转染率，导致机体发热、低血压、呼吸窘迫、血管内凝血及内毒素性休克综合征。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸CDeoxyribonucleicAcid)GB/T 40170-2021 DNase:脱氧核糖核酸酶CDeoxyribonucle

5、ase)HPLC:高效液相色谱CHigh Performance Liquid Chromatography)RNA:核糖核酸CRibonucleicAcid)5 一般性原则质粒作为基因工程重组技术的常用载体，质粒的质量(浓度、构型、纯度、内毒素含量)是蛋白表达、细胞转染效率的关键。获得高纯度的质粒，需要实验者理解质粒提取原理，针对不同菌种、不同性质和大小的质粒，选用恰当的方法，有效地控制提取过程中的各种影响因素。6 抽提原理利用离子去污剂、强碱等试剂裂解宿主细胞，使得质粒从细胞中释放出来，再弃除质粒中的蛋白、基因组DNA等杂质，经异丙醇或乙醇沉淀DNA，最终得到纯化质粒。7 抽提方法7.1

6、抽提方法的选择7.1.1 影晌因素质粒抽提时应结合菌种以及含有的质粒的特性、实际应用等综合选择抽提方法和试剂，可考虑包括但不限于以下因素:大质粒在抽提过程中容易受损，宜用温和裂解法，操作轻柔，最大程度缓冲高渗透压的细菌质粒释放时的压力;小分子质量质粒可以选用相对较剧烈的方法来分离;一些菌株用去污剂或加热裂解时可释放较多的糖类，这类菌株制备质粒时，需注意裂解温度;具有限制性核酸内切酶A的菌株建议采用酣-氯仿进行抽提;在细菌繁殖的对数生长期中期加入氯霉素可以增加质粒的拷贝数。7.1.2 抽提方法分类及特点根据抽提原理，可将质粒抽提方法分为四类，即硅胶柱法、磁珠法、盼氯仿法和离子交换法。基本原理及特

7、点见表10表1几种质粒抽提原理及特点方法原理特点硅胶柱法高盐条件下，硅胶与DNA分子有高亲 和力，低盐或双蒸适用于高通量质粒小量抽提水洗脱DNA磁珠法采用一种纳米磁珠微珠材料.亥磁珠经硅是基修饰后，适用于微量样品的提取，效率高，DNA分子可与之发生特异性结合便于自动化操作酣使蛋白质变性并抑制DNase活性，氯仿去除过量盼、质粒三级结构完整，适用于高质量盼氯仿法利于有机相与液相分层，异丙醇具有强疏水作用，用于沉淀DNA质粒抽提2 GB/T 40170-2021 表1(续)方法原理特点离子交换法低盐低pH条件下，DNA与离子交换剂结合，高盐高pHI适用于大规模质粒抽提，超螺旋比条件下洗脱DNA例高

8、7.2 操作步骤7.2.1 硅胶柱法硅胶柱法抽提操作步骤按照商业吸附柱抽提试剂盒说明书进行。7.2.2 磁珠法磁珠吸附法抽提操作步骤按照商业磁珠法抽提试剂盒说明书进行。7.2.3 酣-氯仿法盼氯仿法抽提操作步骤按照附录A进行。7.2.4 离子交换法离子交换法抽提操作步骤按照附录B进行。8 检测8.1 检测项目质粒的检测包括液体外观、序列验证、浓度测定、纯度检测、超螺旋比例检测、残余RNA和残余基因组DNA检测、细菌内毒素检测、限制酶酶切分析、细菌检测等项目，根据不同的项目采用不同的检测方法。8.2 检测项目的选择根据试验用途，选择不同的检测项目。一般用于分子克隆、测序、定点突变、印迹杂交、文库

9、构建、探针合成、转染或转化等建议对质粒浓度、纯度、超螺旋程度、残余RNA、残余基因组DNA检测和限制酶酶切分析。用于转染试验(哺乳动物细胞)、病毒传导、CAR-T等细胞治疗相关病毒载体的生产制备、基因疫苗和基因治疗研究、抗体或蛋白生产、动物学研究等宜增加内毒素检测和细菌检测试验。8.3 检测方法8.3.1 液体外观肉眼观察，参考结果见附录C。8.3.2 序列验证按照GB/T34265执行，对质粒进行序列测定，参考结果见附录C。8.3.3 浓度测定按照GB/T34796执行，参考结果见附录C。GB/T 40170-2021 8.3.4 纯度检测按照GB/T34796执行，OD260/OD280在

10、1.8至2.0之间，OD260/0D230在2.0至2.5之间，琼脂糖凝胶电泳法检测无其他杂带，肉眼可见，可用于后续试验。参考结果见附录C。8.3.5 超螺旋比例采用高效液相色谱法检测质粒超螺旋比例，利用超螺旋质粒和RNA.基因组DNA碎片的疏水性质的差异，将待测样超螺旋质粒和其余DNA、RNA分离。方法、设备运行参数按照附录D执行，根据检测结果计算目标峰面积占所有峰面积的比值。参考结果见附录C。8.3.6 残余RNA、残余基因组DNA的检测采用琼脂糖凝胶电泳法对残余RNA、残余基因组DNA进行检测，肉眼可见，且限制酶酶切分析后不消失。参考结果见附录C。8.3.7 细菌内毒素检测采用益试剂检测

11、法检测细菌内毒素，检测方法见中华人民共和国药典:2020年版.四部，细菌内毒素检查法。参考结果见附录C。8.3.8 限制酶酶切分析质粒用限制性酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，参考结果见附录C。8.3.9 细菌检测按照GB4789.3中的大肠菌群计数平板计数法进行，同时以涂布生理盐水平板为对照，元菌落生长。参考结果见附录C。9 质量控制9.1 人员质粒抽提和检测技术人员应由具备分子生物学、微生物学及相关教育背景的人员担任O涉及质粒抽提及检测的技术人员应该完全了解菌种培养的相关工作，应掌握质粒检测等相关理论知识和相关试验基础。检测人员应该接受适当的内部或者外部培训，培训的内容应该包括但是不限于:

12、一一菌种培养技术，包括元菌实验室操作技能;掌握质粒分子生物学特性;一一环境控制;定期进行人员的测量能力考核。9.2 仪器设备检测仪器应符合预期要求的性能参数和规格。仪器设备的使用应严格按照标准操作程序进行操作。主要分析设备的操作规程应制定得详细、清楚。定期对仪器设备进行检测或校准。4 GB/T 40170-2021 9.3 式齐。质粒抽提及检测涉及的相关试剂需从具备专业资质并经过验证核实的供应商处采购，且具备检验合格证明文件。检测试剂应严格按照使用方法正确使用。检测试剂的使用应具有严格的文件记录制度，包括试剂的标识、使用时间等信息。9.4 实验室通用要求应满足生物安全一级CBSL-l)实验室要

13、求，遵循分区明确、单一流向、因地制宜、方便使用的原则，避免交叉污染。实验室DNA污染一般来源于气溶胶。因此，质粒抽提和检测以及实验室工作区域的组织及良好的试验操作应基于:严格的工作流程;样品的单向流动原则，具体要求应符合GB/T19495.1中的规定。10 样品保存质粒贮存于一20oc冰箱，避免反复冻融O长期保存建议放置-800C超低温冰箱。11 报告质粒抽提后应附抽提和检测报告单或等同的指导性文件，格式见附录E。文件内容应至少包括以下部分:a)名称;b)总量;c)外观;d)浓度;e)OD260/0D280;f)OD260/0D230;g)超螺旋比例;h)RNA残留;i)基因组DNA残留;j)

14、细菌检测;k)细菌内毒素检测;1)测序;m)限制酶酶切分析;川标签;。)保存条件及期限。12 废弃物处理废弃物处理按照GB/T27403和GB/T19495.2中的规定执行。GB/T 40170-2021 A.1 试验试剂A.1.1 葡萄糖CGlucose,C6 HI2 06)。附录A(规范性)酣-氯仿法A.1.2 二三起甲基氨基甲:皖TrisChydroxymethyl)methylaminomethane THAM,Tris,C4 HIl N03J。A.1.3 盐酸CHydrochloric acid,HCl)。A.1.4 乙二胶囚乙酸二饷CEthylenediaminetetraacet

15、icacid disodium salt,Na2 EDTA,ClO H11 Nz Na2 08)。A.1.5 核糖核酸酶ACRNaseA)。A.1.6 氢氧化饷CSodiumhydroxide,NaOH)。A.1.7 十二烧基硫酸纳CSodiumdodecyl sulfate,SDS,CI2 HZSS04 Na)。A.1.8 醋酸押CPotassiumacetate,CH3 COOK)。A.1.9 冰醋酸CAceticAcid，CH3COOH)。A.1.10 盐酸肌CGuanidine Hydrochloride,Gu-HCl,CH6 CIN3)。A.1.11 乙醇CEthanol,Cz H6

16、 0)。A.1.12 异丙醇CIsopropanol,C3日80)。A.1.13 苯盼CPhenol，C6 H5 OH)。A.1.14 三氯甲:皖CTrichloromethane，氯仿，CHC13)。A.1.15 异戊醇CIsoamylalcohol,3-甲基丁醇，CsH1ZO)。A.1.16 磁珠悬浮液(内含特异性吸附质粒的磁珠)。A.1.17 溶液1C pH8.0):50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L T ris-Cl,10 mmol/L ED丁A，100g/mLRNase A A.1.18 溶液2:200mmol/L NaOH,l%SDS。A.1.19 榕液3CpH5.5):3

17、mol/L醋酸伸。A.1.20 Buffer W2:20 mmol/L T ris-Cl,75%乙醇。A.1.21 TE溶液CpH8.0):10 mmol/L T ris-Cl,1 mmol/L EDTA。A.1.22 75%乙醇榕液CC2H5 OH)。A.1.23 RNase A溶液，10mg/mL,-20 oc保存，避免反复冻融。A.2 操作步骤A.2.1 分步收集2mL4 mL菌液到2mL离心管中，12000 r/min，离心1min，弃上清。A.2.2 向离心管中加入250L榕液l(已加人RNaseA)，涡旋振荡使细胞重悬。A.2.3 向离心管中加人250L溶液2，温和翻转离心管6次1

18、0次，使菌体充分裂解，液体变得澄清。A.2.4 向离心管中加人350L溶液3，温和翻转离心管6次10次，此时可观察到管内出现白色絮状物，12000 r/min室温离心10min。A.2.5 取上清于新的2.0mL EP管中，并记录体积。GB/T 40170-2021 A.2.6 加等体积的苯盼/氯仿溶液，充分振荡混匀，12000 r/min离心10mino A.2.7 重复A.2.6。A.2.8 小心吸取上清于新的2.0mL EP管中，加等体积的异丙醇混匀，12000 r/min离心10mino A.2.9 小心弃去上清。A.2.10 加人1mL 75%乙醇清洗沉淀，12000 r/min离心

19、1min，弃去上清。A.2.11 置于超净工作台将残留乙醇吹干，加50L100LddHzO溶解，一20oC保存。7 GB/T 40170-2021 B.1 试验试剂B.1.1 葡萄糖CGlucose，C6H12 06)。附录B(规范性)离子交换法B.1.2 三捏甲基氨基甲皖TrisChydroxymethyl)methyl aminomethane THAM,Tris,C H11 N03。B.1.3 盐酸CHydrochloric acid，日Cl)。B.1.4 乙二胶四乙酸二铀CEthylenediaminetetraaceticacid disodium salt,Na2 EDTA,Co

20、H14 N2 Na2 08)。B.1.5 核糖核酸酶ACRNaseA)。B.1.6 氢 氧化铀CSodiumhydroxidE:,NaOH)。B.1.7 十二皖基硫酸饷CSodium dodecyl sulfate,SDS,C12 H25 S04 Na)。B.1.8 醋酸押CPotassiumacetate,CH3 COOK)。B.1.9 冰醋酸CAceticAcid，CH3COOH)。B.1.10 盐酸肌CGuanidine H ydrochloride,Gu-HCI,CH6 C1N3)。B.1.11 乙醇CEthanol，C2 H6 0)。B.1.12 氯化饷CSodiumchloride

21、,NaC)。B.1.13 3-CN吗琳基)丙磺酸(MOPS，C7H1SN04 S)。B.1.14 聚乙二醇辛基苯基酷TritonX-100，CI4H220CC2日40)71J。B.1.15 异丙醇CIsopropanol,C3 H8 0)。B.1.16 Buffer PICpH8.0):50 mmol/L Tris-Cl,10 mmol/L EDT A,100,ug/mL RNase A。B.1.17 Buffer P2:200 mmol/L NaOH,1%SDS。B.1.18 Buffer P3CpH5.5):3 mol/L醋酸饵。B.1.19 Buffer QBTCpH7.0):750 m

22、mol/L NaCl,50 mmol/L MOPS,0.15%Triton X-100。B.1.20 Buffer QC(pH7.0):1.0 mol/L NaC,50 mmol/L MOPS,15%异丙醇。B.1.21 Buffer QFCpH8.5):1.25 mol/L NaCI,50 mmol/L MOPS,15%异丙醇。B.1.22 TE溶液CpH8.0):10 mmol/L Tris-Cl,l mmol/L EDTA。B.2 操作步骤B.2.1 从转化的细菌平板中挑取单菌落，接种到4mL液体培养基(含相应的抗生素),37 oC,220 r/min培养6h。B.2.2 取100L上述

23、菌液接种到300mL选择性培养基中，37oC,220 r/min，培养16h。B.2.3 收集B.2.2中菌液于500mL离心杯中，4o C,8 000 p，离心10min。B.2.4 弃上清，并倒扣在吸水纸上，加人30mL,4 oC预冷的BufferP1(已加人RNaseA)，反复吹打沉淀直至完全混匀oB.2.5 加入30mL细胞裂解液BufferP2，轻柔地上下颠倒混匀4次6次，在室温下孵育时间不要超过5min。B.2.6 加入30mL预冷的BufferP3，立即颠倒混匀6次8次(动作要轻柔)，在冰上孵育10min,4 oC,8 000 g离心20mino B.2.7 在层析柱的顶端加滤纸

24、，沿滤纸边缘缓慢加入20mL的BufferQBTC平衡层析柱)。B.2.8 将B.2.6中的上清小心移到层析柱中(不可将沉淀绕动)，让液体自由流下。8 GB/T 40170-2021 B.2.9 加人20mL Buffer QC清洗层析柱一次。B.2.10 加人20mL Buffer QF洗脱DNA，准备对应的50mL的离心管分别收集洗脱液。B.2.11 加入0.7倍体积异丙醇，上下颠倒混匀，在冰上孵育30min以上。B.2.12 4 oC,8 000 g离心20min。B.2.13 小心弃去上清。注意:不要将沉淀倒掉。B.2.14 加人2mL 75%乙醇清洗沉淀，4o C,8 000 g离J

25、L10 min，弃上清。B.2.15 重复B.2.14。B.2.16 置于超净工作台将残留乙醇吹干，加人500，uL的TE溶液或灭菌水恪解DNA。GB/T 40170-2021 附录C(资料性)质粒检测参数及参考结果质粒检测参数及参考结果见表C.l。表C.1质粒检测参数及参考结果一览表检测项目参考结果液体外观肉眼观察清澈、透明序列验证与目标序列一致，100%正确浓度检测根据定制可稀释或浓缩，一般0.1g/Ll月/Lo D260/0 DZ80 1.8 2.0 纯度检测OD260/0Dz30 2.0 2.5 有无其他杂带无超螺旋比例大于或等 于80%残余RNA琼脂糖凝胶电泳不可见残余基因组DN A

26、琼脂糖凝胶电泳不可见细菌内毒素细胞转染用，0.1EU/g DNA 限制酶酶切分析可见目的条带细菌检测无菌落生长10 GB/T 40170-2021 附录D(规范性)高效液相色谱法采用高效液相色谱法检测质粒超螺旋比例，操作步骤如下:将疏水层析柱Source15 PHE column连接到高效液相色谱系统，检测波长260nm，柱温为室温，流速1mL/min;一一用1.5mmol/L硫酸镀、10mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)的溶液平衡层析柱;一液体质粒为待测共试样液，供试样液和平衡溶液按照1:10混匀，作为上样?夜;一取30L稀释后的上样液进样，并使用平衡液洗脱0.8min;一一再用1

27、0mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)的溶液洗脱0.7min;一一接着用1.5mmol/L硫酸镜、10mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)的海液洗脱5.5min;一一收集吸光度和电导率数据;一一计算目标峰面积占所有峰面积的比值。11 GB/T 40170-2021 质粒报告单的格式见表E.l。序 号参数名称2 总量3 外观4 浓度5 OD260/0D2 80 6 OD260/0D230 7 超螺旋比例8 RNA残留9 基 因组DNA残留10 细菌检测11 细菌内毒素 检测12 测序13 限制酶酶切分析14 标签15 保存条件及期限12 附录E(资料性)质粒报告单表E.1质粒报告单格式结果GB/T 40170-2021 参考文献lJ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020年版.四部.北京:中国医药科技出版社，2020.13