课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段.pptx

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1、多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段专题五 课题2朝阳市第一高级中学 于莉姝 课题背景PCR技术能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万分的DNA拷贝。这项技术有效的解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛的应用于刑侦破案，遗传疾病的诊断，基因克隆等各方面。【学习目标】1.理解PCR的原理、条件和反应过程2.比较体内DNA 复制和PCR扩增过程 DNA分子的分子的结构构C C、H H、O O、N N、P P1.1.元素元素组成：成：脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.2.基本基本单位位:一、基一、基础知知识P脱氧核糖脱氧核糖含氮碱基含氮碱基1 12

2、25 543磷酸基磷酸基团（在（在55的位置的位置上）上）一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基磷酸基磷酸基磷酸基团团上的上的上的上的“OH”OH”OH”OH”和和和和另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第3 3 3 3位碳原子位碳原子位碳原子位碳原子上的上的上的上的羟羟基基基基之之之之间间失去一分子水，形成失去一分子水，形成失去一分子水，形成失去一分子水，形成磷酸二磷酸二磷酸二磷酸二酯键酯键，即在即在即在即在相相相相邻邻的的的的两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸的的的的3333和和和和5555碳原子碳原子

3、碳原子碳原子之之之之间间形成磷酸二形成磷酸二形成磷酸二形成磷酸二酯键酯键。数量。数量。数量。数量庞庞大的四种脱氧核苷酸通大的四种脱氧核苷酸通大的四种脱氧核苷酸通大的四种脱氧核苷酸通过过33，5-5-磷酸二磷酸二磷酸二磷酸二酯键酯键彼此彼此彼此彼此连连接起来形成脱氧核苷酸接起来形成脱氧核苷酸接起来形成脱氧核苷酸接起来形成脱氧核苷酸链链。通常将通常将通常将通常将DNADNA的的的的羟羟基基基基“OH”OH”OH”OH”末端称末端称末端称末端称为为3333端，而磷酸基端，而磷酸基端，而磷酸基端，而磷酸基团团的末端称的末端称的末端称的末端称为为5555端端端端3.3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链的形

4、成脱氧核苷酸链结构简图脱氧核苷酸链结构简图DNADNA分子的平面结构分子的平面结构ATGCAGCT氢氢键键5端端3端端5端端3端端 识别识别：-OH末端末端为3;磷酸基磷酸基团的末端的末端为5。DNA复制的方向复制的方向引物引物DNA母链母链DNADNA的复制方向的复制方向总是从总是从子链的子链的5 5端向端向3 3端端延伸延伸引物从模板链引物从模板链33端结合端结合思考：为什么需要引物？因为因为DNADNA聚合酶不能从头开始聚合酶不能从头开始DNADNA复制。复制。DNA DNA聚合酶聚合酶只能从引物只能从引物3 3 端延伸端延伸DNADNA链链（合成子链）。因为（合成子链）。因为DNADN

5、A聚合酶聚合酶只能将新的核苷只能将新的核苷酸加到已有的酸加到已有的DNADNA双链上，双链上，所以所以DNADNA复制需要引复制需要引物。物。小小结引物引物结合在母合在母链的的3端端DNA聚合聚合酶：不能从：不能从头开始合成开始合成DNA 只能从只能从3端延伸端延伸DNA链子子链合成：从引物开始，直到合成：从引物开始，直到结束束 延伸方向延伸方向总是是5 端向端向3端端从图中A、B、C、D四种单链片段中选取引物组合，进行目的基因的扩增。二.PCR技术的原理1.DNA的热变性原理变性（加热80-100）双链DNA 单链DNA 复性(缓慢冷却)重复重复3030次次1 1 步骤：变性步骤：变性 复性

6、复性 延伸延伸三三 PCRPCR的反应过程的反应过程90 90 以上以上50 50 左右左右72 72 左右左右2 2 体外体外PCRPCR扩增扩增DNADNA的条件：的条件：模板：模板：原料：原料：酶：酶：引物：引物：DNADNA的两条链的两条链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶引物引物、引物、引物在一定的缓冲液中进行在一定的缓冲液中进行严格控制温度严格控制温度模板DNA 3 3 5 5 三三 PCRPCR的反应过程的反应过程 5 50引物引物1 1引物引物2 2 5 5 3 3 5 3 3 95三三 PCRPCR的反应过程的反应过程 5 引物引物1 1引物引物

7、2 2 5 5 3 3 5 3 3 72Taq酶Taq酶子链子链子链子链第第1 1轮结束轮结束第第2 2轮开始轮开始三三 PCRPCR的反应过程的反应过程1 1、上一次循环的产物作为下一次循环模板上一次循环的产物作为下一次循环模板2 2、DNADNA聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处于两个引处于两个引物之间的物之间的DNADNA序列，序列，使这段固定长度的序列使这段固定长度的序列呈呈指数扩增指数扩增。PCRPCR的反应过程总结：的反应过程总结：循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸预变形预变形预变形预变形94C,10min94C,10min94C,

8、10min94C,10min30303030次次次次4444，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次4444，1min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min返回返回四生物体内四生物体内DNA复制与复制与PCR反应的比较反应的比较体内复制体内复制PCR反应反应解旋解旋在解旋酶作用下，细胞提供能在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开量，部分解开加热至加热至90 以上时，双链全部以上时，双链全部解开，不需解旋酶解开

9、，不需解旋酶引物引物种类种类2种种2种种合成子链合成子链一条链连续合成，另一条链不一条链连续合成，另一条链不连续合成连续合成分别从两条链的引物端开始，分别从两条链的引物端开始，都是连续合成都是连续合成特点特点边解旋边复制，半保留复制边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增体外迅速扩增DNA聚合聚合酶酶（细胞自身的，不耐高温）（细胞自身的，不耐高温）Taq酶（耐高温）酶（耐高温）循环次数循环次数受生物体自身控制受生物体自身控制30多次多次相同点相同点都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行进行，子链延伸方向均为子链延伸方向均为55端向端向 33端端本本节小小结一、一、PCRPCR原理原理DNADNA双链双链变性（加热变性（加热80-10080-100 ）单链单链复性（复性（缓慢缓慢冷却）冷却）二、二、PCRPCR的反应过程的反应过程步骤：变性步骤：变性 复性复性 延伸延伸PCRPCR扩增扩增DNADNA的条件：模板、酶、引物、原料的条件：模板、酶、引物、原料三、细胞内三、细胞内DNADNA复制与复制与PCRPCR技术比较技术比较