目的基因与克隆载体的体外重组.ppt

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1、第五章第五章 目的基因与载体的目的基因与载体的 体外重组体外重组基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切切切接接接接转转转转增增增增检检检检连接时考虑因素连接时考虑因素实验步骤尽量简单易行实验步骤尽量简单易行连接形成的节点序列应能被重新切割连接形成的节点序列应能被重新切割对转录、转译中密码阅读不发生干扰对转录、转译中密码阅读不发生干扰u粘性末端连接粘性末端连接u平末端连接平末端连接u末端延伸连接：末端延伸连接：连接方式连接方式同聚物加尾同聚物加尾加人工接头加人工接头加加DNA衔接物衔接物粘性末端连接粘性末端连接粘性末端连接粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连

2、接单酶切产生的粘性末端的连接单酶切产生的粘性末端的连接单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）（同种酶）（同种酶）（同种酶）5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAAAATTCG5 退火退火退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG5 GCTTAA 55 AATTCG5 5 GAATTCCTTAAG5 EcoRIEcoRI粘性末端连接粘性末端连接粘性末端连接粘性末端连接单

3、酶切产生的粘性末端的连接单酶切产生的粘性末端的连接单酶切产生的粘性末端的连接单酶切产生的粘性末端的连接（同尾酶）（同尾酶）（同尾酶）（同尾酶）BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火退火退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIBclITGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT粘性末端连接粘性末端连接粘性末端

4、连接粘性末端连接双酶切产生的粘性末端的连接双酶切产生的粘性末端的连接双酶切产生的粘性末端的连接双酶切产生的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRIEcoRI5GCCTGAAATTCG5 退火退火退火退火GCCTGAAATTCG5 GCTTAA 5 GACTTAT4-DNA T4-DNA ligaseligaseGAATTCCTTAAG5 5GGACTTCCTGAA5 GCTTAA 55 GACTTA5 5 GAATTCCTTAAGEcoRIEcoRIGGACTTCCTGAABamBamBamBam平末端连接平末端连接平末端连接平末端连接HpaIHpaI5

5、5GTTAACCAATTGGTTAACCAATTG5GTTCAA AACTTG5 5 CCCGGG5 GGG CCC3 T4-DNA T4-DNA ligaseligaseCCCAACGGGTTG5 5GTTGGGCAACCC5 CCCGGGGGGCCC5 StuIStuI3 平末端连接平末端连接平末端连接平末端连接-不同粘性末端的平端连接不同粘性末端的平端连接不同粘性末端的平端连接不同粘性末端的平端连接BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA T4-DNA ligaseligase

6、CGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstIPstI3 T4-DNA T4-DNA polpol切平切平切平切平5 CG5 GCKlenowKlenow补平补平补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC粘性末端的更换粘性末端的更换粘性末端的更换粘性末端的更换BamHIBamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseKlenowKlenow补平补平补平补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG5

7、5GGATCCTGCAGGATCCCCTAGGACGTCCTAGG5 5PstIPstICTGCAGGACGTCPstIPstI linker linker末端末端转移移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP 随机加于随机加于DNA分子的分子的3-OH端端5 p3 HOOH 3 p 5 TDTTDTMgMg2+2+dATPdATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p3 HOp 5 同聚物尾巴同聚物尾巴 Poly（dA）末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾C 3 GG5 G 3C5C3 GT

8、4-DNA T4-DNA ligaseligaseTdTTdTTdTTdTdTTPdTTPdATPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1S1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热加热加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT末端延伸连接末端延

9、伸连接末端延伸连接末端延伸连接同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾 （平齐末端）平齐末端）平齐末端）平齐末端）末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾 （3 3 3 3 突出末端）突出末端）突出末端）突出末端）CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火退火退火PstPst I IPstPst I IC3CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGG

10、ACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenowPstPst I ISphSph I I末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接末

11、端延伸连接同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾同聚物加尾 （5 5 5 5 突出末端）突出末端）突出末端）突出末端）5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA T4-DNA ligaseligase5 5KlenowKlenow补平补平补平补平KlenowKlenow补平补平补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTTdTTdTdGTPdGTPdCTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCC CCTAGGATCCCCCCCCCTA

12、GGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火退火退火BamHBamH I IBamHBamH I IEcoREcoR I IBamHBamH I I人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面 带有一带有一 至数个限制酶识别位点至数个限制酶识别位点作用：加至待克隆的平末端作用：加至待克隆的平末端DNA片段两片段两侧，酶切后切

13、后 产生粘性末端生粘性末端末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接人工接头加尾人工接头加尾人工接头加尾人工接头加尾CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCC5 EcoREcoR I I末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接人工接头加尾人工接头加尾人工接头加尾人工接头加尾55 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA T4-DNA ligaseligase5 5T4-DNA T4-DNA ligaseligase5CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCCEcoREcoR I ICCGGGCTTAAAATTCGGGCCGAATTCGGCTTAAGCCCCGAATTCG

14、GCTTAAG退火退火退火退火EcoREcoR I IEcoREcoR I IEcoREcoR I ICCGAATTCGGGGCTTAAGCCDNADNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端 （与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘（与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘 性末端（与载体粘端连接）性末端（与载体粘端连接）末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接末端延伸连接DNADNADNADNA衔接物加尾衔接物加尾衔接物加尾衔接物加尾CCG5 GGCTTAA5 EcoREcoR I I AATTCGG5 GCC5 EcoREcoR I

15、 I重组率重组率重组率重组率重组率的定义：重组率的定义：重组率的定义：重组率的定义：重组率重组率=含有外源含有外源DNADNA的重组分子数的重组分子数/载体分子总数载体分子总数 （在常规实验条件下，重组率一般为（在常规实验条件下，重组率一般为25-75%25-75%）重重组组率率是是衡衡量量连连接接反反应应效效率率的的重重要要指指标标，较较高高的的重重组组率可以大大简化率可以大大简化DNADNA重组的后续操作。重组的后续操作。重组率重组率重组率重组率提高重组率的方法：提高重组率的方法：提高重组率的方法：提高重组率的方法：提高外源提高外源DNADNA片段与载体的分子比片段与载体的分子比：5 5:

16、1 1 10 10:1 1 载体载体DNADNA分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团：5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火退火退火退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 GAATTCCTTAAG5 重组率重组率重组率重组率提高重组率的方法：提高重组率的方法：提高重组率的方法：提高重组率的方法：人工构建粘性末端：人工构建粘性末端：CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3 C5C3 GTACGT4-DNA T4-DNA ligaseligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火退火退火退火C3CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenow